CRISPR) yra trečios kartos genomo redagavimo technika: CRISPR sukėlė revoliuciją pasaulyje

Klasteriniai reguliariai tarpais išdėstyti trumpi palindrominiai pasikartojimai (CRISPR) yra trečios kartos genomo redagavimo technika, kuri savo didelio našumo rezultatais sukėlė revoliuciją pasaulyje. Ji buvo naudojama įvairioms biologinėms ligoms ir infekcijoms gydyti. Įvairios bakterijos ir kiti prokariotai (pvz., archėjos) taip pat turi CRISPR/Cas9 sistemas, skirtas apsiginti nuo fagų. Pranešta, kad CRISPR/Cas9 pagrįstos strategijos gali slopinti trigubai neigiamo krūties vėžio (TNBC) augimą ir progresavimą, nukreipdamos į potencialiai pakitusius atsparumo genus, transkripciją ir epigenetinį reguliavimą. Šios terapinės intervencijos gali padėti spręsti sudėtingas problemas, tokias kaip atsparumas vaistams, stebimas net TNBC. Šiuo metu CRISPR/Cas9 tiekimui į tikslines ląsteles naudojami įvairūs metodai, pavyzdžiui, fiziniai (mikroinjekcijos, elektroporacijos ir hidrodinaminiai režimai), virusiniai (adeno-asocijuotas virusas ir lentivirusas) ir nevirusiniai (liposomos ir lipidų nanodalelės). Nors buvo sukurti įvairūs modeliai, skirti tirti TNBC molekulines priežastis, jautrių ir tikslinių metodų, skirtų genomo redagavimo įrankiams in vivo pristatyti, trūkumas riboja jų klinikinį taikymą. Apibendrinant, šioje apžvalgoje išsamiai nagrinėjama CRISPR/Cas9 gydymo TNBC pažanga, iššūkiai, apribojimai ir perspektyvos, remiantis esamais įrodymais. Taip pat pabrėžiame, kaip dirbtinio intelekto ir mašininio mokymosi derinys gali pagerinti CRISPR/Cas9 strategijas TNBC gydymui.
Vėžiui būdingas nekontroliuojamas ląstelių dalijimasis, ląstelių ciklo kontrolinių taškų sutrikimas ir naviko slopinamųjų genų (TSG) mutacijos (Matthews ir kt., 2022). Tarp skirtingų vėžio tipų krūties vėžys yra labiausiai paplitęs vėžio tipas moterims ir pasižymi dideliu mirtingumu visame pasaulyje (Waks ir Winer, 2019). Krūties vėžys yra heterogeniška liga, pasižyminti įvairiomis savybėmis, tokiomis kaip histologiniai ir biologiniai požymiai, klinikinis vaizdas ir elgsena bei atsakas į gydymą (Weigelt ir kt., 2010). Krūties vėžio klasifikacija suteikia tikslių įžvalgų apie krūties vėžio diagnozę ir naviko prognozę. Įprastų biožymenų ir klinikopatologinių požymių naudojimas buvo pagrindinis krūties vėžio klasifikavimo kriterijus (Tsang ir Tse, 2019). Krūties vėžio prognozei ir atsakui į gydymą įtakos turi daugybė veiksnių, įskaitant estrogenų receptorių (ER), progesterono receptorių (PR), žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptoriaus 2 (HER2/neu) buvimą, histologinį laipsnį, naviko tipą, dydį ir limfmazgių metastazes (Al-Tubaiti, 2020). Nustatyti penki vidiniai krūties vėžio molekuliniai potipiai: luminalinis A, luminalinis B, HER2 praturtintas, bazalinis ir mažai klaudino turintis vėžys (Prat ir kt., 2015). TNBC yra molekulinis vėžio potipis, kuris neekspresuoja visų ER, PR ir HER2 (Yin ir kt., 2020). Šie patologiniai požymiai yra susiję su TNBC, patvirtinantys jo greitą progresavimą ir agresyvesnį pobūdį nei bet kurio kito tipo krūties vėžys (Feng ir kt., 2018). Be to, Peru ir kt. (2000) panaudojo mikrogardelių technologiją, kad perklasifikuotų krūties vėžį ir nustatytų penkis vidinius krūties vėžio potipius (Cadenas, 2012). Bazalinis krūties vėžys yra krūties vėžio potipis, turintis trigubai neigiamą fenotipą ir susijęs su greita progresavimu. Reikėtų pažymėti, kad visi bazalinio tipo krūties vėžiai dažnai klaidingai diagnozuojami kaip TNBC, tačiau tik 77 % yra TNBC; Priešingai, 71–91 % TNBC atvejų yra bazinio tipo, o tai rodo, kad šie du krūties vėžio tipai sutampa ir atitinka skirtingas klasifikacijas (Wang D.-Y. ir kt., 2019). Todėl reikia apibūdinti TNBC heterogeniškumą, siekiant išsiaiškinti prognozę ir nustatyti galimą atsaką į dabartinį ir būsimą gydymą. Be to, TNBC sudaro 15–20 % visų krūties vėžio atvejų ir yra dažnesnis moterims iki 50 metų. BRCA1 arba BRCA2 mutacijos nustatytos maždaug 20 % TNBC atvejų (Xie ir kt., 2017; Tzikas ir kt., 2017). Tyrimai taip pat parodė, kad TNBC turi savitą imuninę mikroaplinką, kurioje yra daug kraujagyslių endotelio augimo faktorių, su naviku susijusių makrofagų (TAM), į naviką infiltruojančių limfocitų (TIL) ir kitų molekulių, dalyvaujančių naviko augime ir migracijoje. Todėl TNBC mikroaplinkos supratimas yra labai svarbus jo prognozei ir gydymui (Fan ir He, 2022).
Norint įvertinti TNBC prognozę ir užtikrinti veiksmingą gydymą, svarbi tiksli diagnozė, daugiausia pagrįsta imunohistochemija (IHC) ER, PR ir HER2 nustatymui bei mamografija krūties navikams nustatyti. Tačiau mamografija negali tinkamai pavaizduoti naviko viduje esančių požymių, tokių kaip nekrozė ir fibrozė (Deepak Singh ir kt., 2021). Kadangi prasta prognozė ir diagnozė neleidžia gydytojams skirti tinkamų vaistų (Chaudhary, 2020), naudojamos įvairios strategijos, siekiant pagerinti pacientų, sergančių TNBC, priežiūrą. Šiuo metu pacientams, sergantiems TNBC, vartojami du vaistai – doksorubicinas ir ciklofosfamidas – ir jie parodė gerus rezultatus. Be to, vartojami ir kiti platinos preparatai, tokie kaip karboplatina ir cisplatina (Sikov ir kt., 2015). Be to, PARP inhibitoriai, tokie kaip olaparibas, velaparibas ir PF-01367338, buvo naudojami kaip potencialūs chemoterapiniai vaistai TNBC gydymui (Ishino ir kt., 2018). Kadangi pranešama, kad Wnt/b-katenino, NOTCH ir Hedgehog signalizacijos keliai yra susiję su TNBC atsiradimu ir progresavimu, vaistų nukreipimas į šiuos kelius gali būti svarbi strategija (Aysola ir kt., 2013). Nors chirurgija, spindulinė terapija ir chemoterapija išlieka pagrindiniu TNBC gydymo metodu šiandien, padaryta didelė pažanga kuriant naujus gydymo būdus, įskaitant tikslinę terapiją, imunoterapiją, įvairias su CRISPR susijusias genų redagavimo priemones, tokias kaip Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, pirminį redagavimą ir CRISPR/Cas9 tikslinę genų terapiją. Čia daugiausia dėmesio skirsime įvairioms su CRISPR susijusioms genų redagavimo priemonėms, naudojamoms gydant TNBC. Iš jų CRISPR/Cas9 sulaukė didelio dėmesio.
Cas9n, dar žinomas kaip Cas9 nikazė, yra genetiškai modifikuotas Cas9 baltymo variantas, gautas iš CRISPR/Cas9 genomo redagavimo sistemos (Gupta ir kt., 2019). Originalioje formoje Cas9 baltymas turi du nukleazių domenus: RuvC ir HNH, kurių pagrindinė funkcija yra abiejų DNR grandinių skaidymas. Tačiau Cas9n baltyme vienas iš nukleazių domenų, HNH, yra genetiškai mutuojamas ir tampa neaktyvus. Todėl Cas9n HNH domenas lieka neveikiantis. Tik RuvC domenas lieka aktyvus, leisdamas Cas9n kirpti arba sukurti trūkius atskirose DNR grandinėse (Trevino ir Zhang, 2014). Palyginti su Cas9, Cas9n gali efektyviai sumažinti pašalinius poveikius ir tiksliai pagerinti ląstelių atstatymo mechanizmus. Cas9n gali būti naudojamas įvairioms problemoms spręsti, pavyzdžiui, trūkių kūrimui tam tikrose dvigrandės DNR vietose. Šiuo tikslu dvi Cas9n molekulės buvo sujungtos ir naudojamos kartu (Yee, 2016). Mišrios linijos kinazė 3 (MLK3) yra mitogenų aktyvuojama baltymų kinazė, kuri yra pagrindinis reguliatorius TNBC metastazių metu (Cronan ir kt., 2012).
MLK3 gali aktyvuoti kelis signalizacijos kelius, vedančius į TNBC metastazes. Pavyzdžiui, c-Jun N-galinės kinazės (JNK) kelias reguliuoja ląstelių judrumą ir tarpląstelinės matricos degradaciją, o MLK3 aktyvuoja JNK kelią, tokiu būdu didindamas ląstelių judrumą ir suteikdamas joms invazinių savybių (Rattanasinchai ir Gallo, 2016). MLK3 taip pat reguliuoja EMT. Norėdamas tai padaryti, jis aktyvuoja tokius transkripcijos faktorius kaip Snail, Slug ir Twist. Šie faktoriai slopina epitelio žymenų ekspresiją ir skatina mezenchiminių žymenų ekspresiją, todėl atsiranda metastazinis fenotipas (Casalino ir kt., 2023). Pastebėta, kad MLK3 atlieka svarbų vaidmenį ECM pertvarkyme ir aktyvuoja proteazes, tokias kaip matricos metaloproteinazės (MMP), kurios skaido ECM. Tai palengvina naviko ląstelių invaziją ir plitimą į tolimas vietas (Katari ir kt., 2019). Taigi, ankstesni tyrimai parodė, kad MLK3 atlieka svarbų vaidmenį TNBC. Rattanasinchai ir Gallo, naudodami TNBC modelius, tyrė MLK3 vaidmenį ir nustatė, kad jis skatina vėžio vystymąsi per specifinius signalizacijos kelius. Jie panaudojo CRISPR/Cas9n MLK3 redagavimui ir pastebėjo reikšmingą TNBC metastazių sumažėjimą (Rattanasinchai ir Gallo, 2016).
dCas9, dažnai vadinamas neaktyviu Cas9, yra modifikuota Cas9 baltymo darinio forma. Skirtingai nuo aktyvaus Cas9, dCas9 neturi endonukleazės aktyvumo, todėl negali sukelti DNR dvigubos grandinės trūkių. Todėl dCas9 gali būti naudojamas tiksliai nukreipti veiksmus į konkrečius genomo regionus be jokių DNR sekos pakeitimų ar modifikacijų (Wang ir kt., 2016). dCas9 baltyme du endonukleazės baltymai, RuvC ir HNH, yra inaktyvuojami slopinant svarbius aminorūgščių likučius. (Richter ir kt., 2016). Nepaisant DNR skaidymo aktyvumo stokos, dCas9 atlieka svarbų vaidmenį genetiniuose tyrimuose ir biotechnologijose. Pavyzdžiui, jis leidžia vizualizuoti specifinius genomo regionus, palengvina transkripcijos reguliavimą ir skatina epigenetines modifikacijas (Brocken ir kt., 2018).
Transkripcijos faktorius ZEB1 (cinko piršto E-dėžutę surišantis homeobox 1) atlieka specifinį ir svarbų vaidmenį tarpininkaujant epitelio-mezenchiminiam perėjimui (EMT) – ląsteliniam procesui, vykstančiam embriono vystymosi, audinių atsistatymo ir vėžio progresavimo metu. Jis apima epitelio ląstelių transformaciją į mezenchimines ląsteles, dėl ko pasikeičia ląstelių morfologija, judrumas, invazyvumas ir kt. (Wu ir kt., 2020). ZEB1 slopina daugelį epitelio žymenų, tokių kaip E-kadherinas ir okludinas, kurie yra atsakingi už ląstelių adhezijos ir epitelio ląstelių poliškumo palaikymą TNBC (Moreno-Bueno ir kt., 2008). Be to, ZEB1 aktyvuoja tam tikrus žymenis, tokius kaip N-kadherinas, vimentinas ir fibronektinas (Konradi ir kt., 2014), ir taip pat reguliuoja genus, dalyvaujančius citoskeleto pertvarkyme, tokius kaip Rho GTPazės ir matricos metaloproteinazės (MMP) (Huang ir kt., 2014). 2022), be to, jis taip pat veikia įvairius signalizacijos kelius, tokius kaip transformuojantis augimo faktorius β (TGF-β), Wnt signalizacija ir kt., tokiu būdu skatindamas naviko invaziją ir metastazes TNBC (Chen ir kt., 2016). Daugybė tyrimų ir mokslinių įrodymų rodo, kad ZEB1 turi didelį potencialą kaip vertinga medžiaga TNBC aptikimui ir terapinei intervencijai. Neseniai atliktame tyrime Waryah ir kt. panaudojo TNBC modelį ir pasiekė visišką ZEB1 slopinimą dCas9. Taigi, jie pastebėjo labai didelį specifiškumą ir beveik visišką ZEB1 slopinimą in vivo sąlygomis (Waryah ir kt., 2023).
CRISPR/Cas12 yra genų redagavimo įrankis, vadinamas CRISPR/Cpf1. Jis kilęs iš CRISPR/Cas sistemos, kur terminas Cas12 reiškia su CRISPR susijusį baltymą 12 (Bharathkumar ir kt., 2022), kuris yra visiškai panašus į Cas9. Vienintelis skirtumas yra tas, kad jame yra Cas12 baltymas. Palyginti su Cas9, Cas12 turi keletą unikalių funkcijų, pavyzdžiui, lipnių galų generavimą genų redagavimo proceso metu, o Cas9 generuoja bukus galus (Wang ir kt., 2021). Ši Cas12 savybė prisideda prie specifinės DNR manipuliavimo technologijos. Kaip baltymas, galintis tiksliai atpažinti ir perpjauti tikslinę DNR, jis yra nepaprastai universalus, todėl yra veiksminga priemonė įvairioms reikmėms, įskaitant genų redagavimą (Pickar-Oliver ir Gersbach, 2019).
Panašiai kaip ir kiti CRISPR variantai, CRISPR/Cas12 taip pat gali išmušti arba aktyvuoti genus TNBC, nukreipdamas į genus, kurie vaidina svarbų vaidmenį jo patogenezėje arba atsake į gydymą (Yang ir Zhang, 2023). Šiam procesui atlikti buvo sukurta kreipiančioji RNR (gRNR), kuri nukreipia Cas12 į tikslinį geną. Kai Cas12 prisijungia prie savo taikinio, ji įterpia dvigubos grandinės trūkius DNR ir aktyvuoja DNR taisymo mechanizmus. Taisymo proceso metu gali būti įtraukti neteisingi nukleotidai, dėl kurių gali atsirasti genų mutacijų ir prarasti funkciją (Zhang ir kt., 2021a). Be to, patobulinta Cas12 fermento versija (vadinama dCas12) taip pat buvo naudojama genams aktyvuoti. Sujungus jį su transkripcijos aktyvatoriumi, galima indukuoti tam tikrus genus ir taip juos aktyvuoti. Ši technologija turi didelį potencialą skatinant naviko slopinamųjų genų aktyvaciją (Sultan ir kt., 2022).
Pradinis redagavimas yra naujai sukurta ir itin pranaši genomo redagavimo technologija. Ji gali labai tiksliai modifikuoti organizmo DNR (Chen ir Liu, 2023). Pradinis redagavimas pasiekiamas integruojant du pagrindinius komponentus: modifikuotą CRISPR/Cas9 fermentą ir atvirkštinę transkriptazę. CRISPR/Cas9 fermento vaidmuo yra selektyviai nukreipti veiksmus į tikslias genomo vietas, o atvirkštinė transkriptazė padeda kruopščiai modifikuoti DNR tikslinėje vietoje (Hassan ir kt., 2021). Pradmenų redagavimo mechanizme pirmasis žingsnis apima pradmenų redagavimo kreipiančiosios RNR (pegRNR) sukūrimą (Standage-Beier ir kt., 2021). Joje yra tikslinė seka ir RNR šablonas, atitinkantis norimą redagavimo vietą tikslinėje DNR. Tada pegRNR įvedama į tikslines ląsteles kartu su pradmenų redagavimo nukleaze (PE2). PE2 yra susiliejęs baltymas, sudarytas iš Cas9 fermento, atvirkštinės transkriptazės ir pradmenų redagavimo adapterio (Martín-Alonso ir kt., 2021). Ląstelės viduje pegRNR ir PE2 kompleksai ieško specifinės DNR, kurią nori modifikuoti. Cas9 fermentas perkerpa DNR ir sukuria šabloną, sudarytą iš pavienių grandžių (Choi ir kt., 2022). Atvirkštinė transkriptazė naudoja šį šabloną DNR paruošimui redagavimui. Kartu su DNR kopijavimu, taip pat įtraukiamos RNR šablono redagavimo instrukcijos. Galiausiai, naujai sukurta DNR grandinė naudojama kaip šablonas DNR trūkiui pataisyti, todėl gaunama pakeista DNR seka, turinti norimą modifikaciją (Ochoa-Sanchez ir kt., 2021). Pradmenų redagavimo mechanizmai gali sukelti plačiai paplitusias genų mutacijas. Jie gali būti nukreipti į taškines mutacijas, įterpimus, ištrynimus ir net genų pakeitimus (Anzalone ir kt., 2019; Chen ir Liu, 2023). Pradmenų redagavimas turi keletą pranašumų, palyginti su ankstesnėmis genomo redagavimo technologijomis. Tai apima didesnį tikslumą, sumažintą netikslinį poveikį ir galimybę redaguoti DNR nesiremiant DNR dvigubų grandžių trūkiais (Anzalone ir kt., 2020).
CRISPR/Cas9 technologija iš pradžių buvo sukurta siekiant apsaugoti bakterijas nuo plazmidžių perkėlimo ir fagų infekcijos, o vėliau buvo pritaikyta kaip efektyvi RNR pagrindu veikianti DNR taikymo priemonė genomo redagavimui (Jiang ir Doudna, 2017). Be to, pranešama, kad CRISPR/Cas9 sistema yra atitinkamai 50 % ir 87 % bakterijų ir archajų genomų (Ishino ir kt., 2018). CRISPR/Cas9 yra potenciali priemonė bet kokiai nenormaliai genetinei sekai ištrinti, įterpti ir koreguoti naudojant in vivo ir in vitro režimus (Sabit ir kt., 2021). Be to, įrodyta, kad CRISPR/Cas9 yra adaptyviosios imuninės sistemos dalis dėl savo specifiškumo dominantiems genams (Chen ir Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 sudaro Cas9 ir viena kreipiančioji RNR (sgRNR). Cas9 yra endonukleazė, sudaryta iš daugelio baltymų komponentų. Be to, Cas9 pasižymi unikaliomis struktūrinėmis ir konformacinėmis savybėmis (Pacesa ir kt., 2022), nes ją sudaro dvi skiltys: atpažinimo (REC) ir nukleazės (NUC). REC skiltis dar skirstoma į tris regionus: REC1, REC2 ir tilto spirales (Cromwell ir kt., 2018). NUC sudaro trys skiltys: RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH ir protospacer gretimo motyvo (PAM) sąveikos domenas (1 pav.) (Song ir kt., 2016). sgRNR sudaro du komponentai, įskaitant CRISPR RNR (crRNR) ir transkoduojančią mažąją RNR (žymeklio RNR) (1 pav.). sgRNR jungia Cas9 baltymą su koneksinais, sudarydama aktyvų kompleksą, dar vadinamą efektoriniu kompleksu (Richter ir kt., 2012). crRNR yra 18–20 nukleotidų bazių pora, kuri atlieka svarbų vaidmenį atpažįstant tikslines DNR sekas. Be to, crRNR poruojasi su tiksline DNR, o tracrRNR veikia kaip karkasas Cas9 nukleazei, kad ši prisijungtų prie tikslinės DNR (Manghwar ir kt., 2019). Kita vertus, PAM seka turi 3 nukleotidus, kurie patvirtina, nurodo ir tarpininkauja efektorinio komplekso prisijungimui prie DNR. Cas9 baltymų komplekso subvienetai RuvC ir HNH pasižymi kataliziniu aktyvumu (Richter ir kt., 2012; Asmamaw ir Zawdie, 2021). Cas9 subvieneto HNH nukleazės domenas skaido su crRNR susijusią DNR grandinę. RuvC nukleazės domenas skaido kitas DNR grandines ir sukuria dvigubos grandinės trūkius (DSB), po kurių aktyvuojami du skirtingi DNR trūkių taisymo mechanizmai (Jiang ir Doudna, 2017) (1 pav.).
1 pav. CRISPR/Cas9 apžvalga (A). CRISPR/Cas9 sistemos komponentai: (i). Cas9 endonukleazė yra atsakinga už tikslinės DNR sekos pjovimą, (ii) viena kreipiančioji (sg) RNR, gaunama susiliejus crRNR ir tra-crRNR chimeroms. (du). Cas9 apima kelis komponentus, tokius kaip Rec I, Rec II, NUC skiltis (HNH ir Ruv C yra subkomponentai) ir PAM sąveikos domenas (C) su atitinkamomis funkcijomis. CRISPR/Cas9 baltymų kompleksas skaido DNR sekas į nekomplementarias ir komplementarias formas (D). CRISPR/Cas9 redaguoja genomą trimis etapais: atpažinimas, pjovimas ir taisymas. Sukurta sg-RNR veda Cas9 ir atpažįsta norimą seką per komplementarinę crRNR komponentę. Cas9 atpažįsta PAM seką ties 5′-NGG-3′ ir ištirpdo DNR, sudarydamas DNR-RNR hibridą ir aktyvuodamas skilimą. Cas9 HNH domenas skaido komplementarinę grandinę, o RuvC domenas skaido nekomplementarinę grandinę. CRISPR/Cas9 taiso dvigrandes DNR ją nutraukdamas dviem būdais: nehomologiniu galų jungimu (NHEJ) ir homologiškai nukreiptu taisymu (HDR). NHEJ taiso dvigrandes DNR be svetimos homologiškos DNR fermentiniu procesu – klaidų linkusiu mechanizmu, kuris gali įterpti arba pašalinti atsitiktines DNR sekas. HDR yra labai specifinis ir jam reikalingi homologiški DNR šablonai.
CRISPR/Cas9 tarpininkaujantys taisymo keliai apima nehomologinį galų sujungimą (NHEJ) ir homologiškai nukreiptą taisymo (HDR) mechanizmus. NHEJ yra klaidų linkęs kelias, nes jis apima įterpimą arba ištrynimą ir nereikalauja jokio modelio taisymo mechanizmo metu. Jis naudoja atsitiktinius nukleotidus standartiniams baltymams generuoti (Abbasi ir kt., 2021). Ši taisymo sistema susideda iš keturių kompleksų, tokių kaip KU kompleksas, kryžmiškai komplementuojantis 4 tipo baltymų kompleksas (XRCC-4), DNR galų apdorojimo fermentas ir baltymų kinazė DNR-PKcs (Abbasi ir kt., 2021). KU komplekso baltymas turi du subvienetus, Ku 70 ir Ku 80, ir atlieka svarbų vaidmenį NHEJ mechanizme, nes taisymo mechanizmas inicijuojamas dviejų subvienetų (Ku 70 ir Ku 80) prisijungimu prie bukų arba beveik bukų tikslinės DNR galų (Abbasi ir kt., 2021), tarnaujant kaip atrama kitiems su NHEJ susijusiems veiksniams pritraukti į pažeidimo vietą (Yang ir kt., 2020). XRCC-4 ir DNR ligazę sudaro atitinkamai 334 ir 911 aminorūgščių, o XRCC4-DNR ligazės IV kompleksas stimuliuoja DNR galų ligavimą (Chatterjee ir kt., 2015). DNR galų apdorojimo fermentas, dar žinomas kaip polinukleotidų kinazės 3′-fosfatas, yra DNR galų apdorojimo fermentas. Jis gali pašalinti 3′P grupę DNR ir fosforilinti 5′OH grupę DSB taisymo metu. Tai taip pat apima vienos grandinės trūkių (SSB) taisymą naudojant SSB taisymo kelią (Chatterjee ir kt., 2015). Baltymų kinazė DNR-PKcs yra nuo DNR priklausoma baltymų kinazė, susidedanti iš PIKK (fosfatidilinozitolio 3-kinazės susijusių kinazių) ir ataksijos telangiektazijos mutavusių (ATM) šeimos katalizinio subvieneto, taip pat su ATM ir Rad3 susijusių ATR, grandinės trūkių (DSB) ir vienos grandinės trūkių (Yue ir kt., 2020; Peng ir kt., 2016).
HDR yra tikslesnis ir tinkamesnis taisymo mechanizmas, nes informacija kopijuojama naudojant nepažeistą homologiško DNR duplekso formą, nors tam reikalingos seserinės chromatidės. Tai vyksta žinduolių ląstelių ciklo S/G2 fazėje. HDR daugiausia pasireiškia mielių rūšyse, tačiau NHEJ yra labai svarbus žinduoliams (Burma ir kt., 2006; Abbasi ir kt., 2021). Visas taisymo mechanizmas parodytas 1 paveiksle.
Kadangi TNBC sukelia genetiniai ir epigenetiniai sutrikimai, piktybinių genominių/epigenominių anomalijų korekcija naudojant CRISPR/Cas9 gali būti tinkamas terapinis metodas (Chen ir kt., 2019). Be to, kai kurie transkripcijos faktoriai, dalyvaujantys ląstelių specifiniame transkripcijos reguliavime, gali pasižymėti unikaliomis vėžio ląstelių savybėmis, o tai rodo, kad transkripcijos reguliavimas gali būti puikus vėžio gydymo metodas (Drost ir kt., 2017). Šių navikų molekulinių ypatybių, tokių kaip genetiniai, epigenetiniai ir transkripcijos defektai, panaudojimas vaistų kūrimui gali pagerinti klinikinius rezultatus ir sumažinti atrankos išlaidas. CRISPR yra potenciali genų redagavimo priemonė, kuri gali ne tik aptikti ir identifikuoti vėžį sukeliančius genominius taikinius, bet ir gali būti naudojama redaguoti, slopinti ir epigenetiškai modifikuoti onkogenus žmogaus ląstelėse (1 lentelė) (Ahmed ir kt., 2021). Buvo atlikta keletas CRISPR tyrimų, siekiant ieškoti genų, susijusių su navikų slopintojais, onkogenais ir atsparumu vaistams. CRISPR/Cas9 naudojimas įvairiems TNBC onkogenams redaguoti parodytas 2 paveiksle.
2 pav. Įvairių TNBC onkogenų genų redagavimas naudojant CRISPR/Cas9, dėl kurio sumažėja naviko augimas ir metastazės. Šie onkogenai yra CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 ir CXCR7, Crypto1, ROR1 ir ST8SIA, kurie yra susiję su TNBC atsiradimu ir metastazėmis.
Vėžio ląstelių migracija, invazija ir epitelio-mezenchiminis perėjimas (EMT) yra susiję su ITGA9. Ankstesni tyrimai parodė, kad ITGA9 yra pagrindinis Notch signalo perdavimo kelio dalyvis ir vaidina įdomų vaidmenį rabdomiosarkomos metastazėse (Molist ir kt., 2020). Be to, nustatyta, kad ITGA9 yra glaudžiai susijęs su pacientų prognoze sergant keliais navikų tipais, įskaitant krūties vėžį (Wang Z. ir kt., 2019). Be to, ITGA9 bioinformatinė analizė parodė, kad jo raiška TNBC buvo žymiai didesnė nei kituose krūties vėžio potipiuose. Padidėjęs ITGA9 lygis yra susijęs su naviko metastazėmis ir recidyvu TNBC pacientams. ITGA9 nokautas CRISPR/Cas9 lėmė vėžio kamieninių ląstelių (CSC) savybes, naviko angiogenezę, naviko augimą ir sumažintą metastazę, skatinant β-katenino skaidymą TNBC (Wang Z. ir kt., 2019).
Kripto-1 priklauso TGF-β šeimai ir yra labai svarbus ankstyvajai embriogenezei, kamieninių ląstelių palaikymui ir vėžio metastazėms (Ishii ir kt., 2021). Taip pat žinomas kaip Tdgf-1, tai onkogeninis GPI įtvirtintas signalinis baltymas, dalyvaujantis primityviosios juostelės, mezodermos ir endodermos formavimosi reguliavime, taip pat kairės/dešinės asimetrijos nustatyme kūno organų vystymosi metu embriogenezės metu (Zhang ir kt., 2021b). Be to, įrodyta, kad Cripto-1 dalyvauja epitelio-mezenchiminiame perėjime (EMT) kaip kamieninių ląstelių žymuo (Zhang ir kt., 2021b). EMT yra labai svarbus ne tik įvairiems procesams, tokiems kaip embriono vystymasis, fibrozė ir žaizdų gijimas, bet ir vėžio invazijai bei metastazėms. Be to, įrodyta, kad Cripto-1 sąveikauja su keturiais Notch receptoriais ir skatina jų potransliacinį brendimą (Brandstadter ir Maillard, 2019). Yra žinoma, kad Notch signalizacijos kelias dalyvauja žmogaus krūties vėžio ląstelių palaikyme. Tyrimai parodė, kad CRISPR/Cas9 sukeliamas Crypto-1 nokautas slopina vėžio augimą ir metastazes. Todėl Crypto-1 gali tapti svarbiu terapiniu taikiniu TNBC (Castro ir kt., 2015).
XCL12 baltymas ir jo chemokinų receptorius CXC (CXCR4 ir CXCR7) atlieka įvairius vaidmenis vėžio ląstelių proliferacijoje, augime, migracijoje ir invazijoje (Wu ir kt., 2015). Šie chemoreceptoriai buvo siejami su TNBC vystymusi per kelis signalizacijos kelius tiek in vivo, tiek in vitro modeliuose (Wu ir kt., 2015). Be to, CXCR4 ir CXCR7 aktyvacija yra susijusi su didesniu jautrumu metastazėms ir prasta TNBC prognoze (Karn ir kt., 2022). Todėl CXCR4 ir CXCR7 nokautas gali tapti veiksmingais vaistų taikiniais krūties vėžio, įskaitant TNBC, gydymui. Yang ir kt. (2019 m.) atliktame tyrime CRISPR/Cas9 buvo panaudotas CXCR4 ir CXCR7 genams ko-nokatuoti ir nustatyta, kad TNBC proliferacija, augimas, migracija ir invazija buvo reikšmingai slopinami (Yang ir kt., 2019).
Krūties vėžio audiniuose pastebėtas padidėjęs miR-3662, TNBC onkogeno, kiekis (Yi ir kt., 2022). Nustatyta, kad miR-3662 slopinimas slopina krūties vėžio naviko augimą ir metastazes tiek in vivo, tiek in vitro (Agarwal ir Gupta, 2021). HBP-1 yra stiprus Wnt/-katenino signalizacijos inhibitorius ir greičiausiai atsakingas už miR-3662 sukeltą TNBC ląstelių augimą. Neseniai Yi ir kt. nustatė, kad miR-3662-HBP1 ašis reguliuoja Wnt/-katenino signalizacijos kelią TNBC ląstelėse (Yi ir kt., 2022). Dėl navikui būdingos ekspresijos miR-3662 gali būti potencialus TNBC terapinis taikinys. Taigi, CRISPR/Cas9 sukelto miR-3662 slopinimo metodas gali būti puikus būdas kurti naujus vaistus TNBC gydymui.
UBR5 yra 300 kDa nukleofosfoproteinas, kuris buvo identifikuotas kaip pagrindinis naviko atsiradimo, metastazių ir imuninio atsako reguliatorius įvairiuose vėžiuose (Shearer ir kt., 2015; Fu ir kt., 2023). Pranešta, kad UBR5 yra labai padidinta TNBC mėginiuose ir stimuliuoja ERα funkciją, sukeldamas proliferaciją per savo ubikvitino ligazės aktyvumą (Bolt ir kt., 2015). Pirminių TNBC mėginių viso egzomo sekoskaitos tyrimai taip pat parodė padidėjusią UBR5 ekspresiją, rodančią jo vaidmenį TNBC vystymesi. Be to, CRISPR/Cas9 sukelta UBR5 ištrynimas parodė reikšmingą TNBC metastazių ir augimo slopinimą eksperimentiniuose pelių modeliuose. Be to, UBR5 įtraukimas į laukinio tipo pelių modelį atkūrė visą jo funkcionalumą, o šis poveikis nebuvo pastebėtas inaktyvuotose mutantinėse padermėse (Liao ir kt., 2017). UBR5 trūkumas yra susijęs su padidėjusia apoptoze, nekroze ir naviko augimo slopinimu TNBC dėl silpnos angiogenezės. Dėl UBR5 praradimo sumažėja naviko plitimas į tolimus organus, o UBR5 sukelia nenormalų EMT, daugiausia mažindamas E-kadherino ekspresiją (Zhang ir Weinberg, 2018). Neseniai buvo įrodyta, kad UBR5 yra labai svarbus IFN-γ sukeltos PDL1 transkripcijos veiksnys TNBC dėl E3 ubikvitinacijos aktyvumo stokos. RNR transkriptomo analizė parodė, kad UBR5 gali turėti sisteminį poveikį su IFN-γ keliu susijusiems genams ir skatinti PDL1 transaktyvaciją, didindamas baltymų kinazės RNR (PKR) ir jos signalo keitiklių bei aktyvatorių aktyvacijos lygius. Transkripcija 1 (STAT1) ir interferono reguliavimo faktorius 1 (IRF1). Tačiau CRISPR/Cas9 tarpininkaujama kombinuota UBR5 ir PD-L1 ekspresijos abliacija turi sinergetinį terapinį poveikį nei bet kuri atskira blokada, darydama didelį poveikį naviko mikroaplinkai (Wu ir kt., 2022). Taigi, CRISPR/Cas9 gali būti svarbi priemonė UBR5 funkcijai slopinti, taip slopinant TNBC metastazes ir naviko augimą.
ROR1 yra I tipo transmembraninis baltymas, kuris ekspresuojamas vėžio ir embriono vystymosi metu, ir buvo identifikuotas kaip onkofetalinis baltymas (Nicholas Borcherding, 2014). Įvairių žmogaus vėžio formų invazinis elgesys yra susijęs su ROR1 reguliacijos padidėjimu. Daug žadantys rezultatai gauti atlikus in vivo ir in vitro tyrimus, kuriuose dalyvavo terapiniai junginiai, nukreipti prieš ROR1 (Chien ir kt., 2016). Padidėjęs ROR1 mRNR kiekis krūties audinių biopsijose taip pat buvo susijęs su agresyviais bazinio tipo krūties (BL) navikais ir jų migracija į kitas kūno dalis. Be to, ROR1 per didelė raiška buvo identifikuota kaip TNBC vystymosi prognostinis žymuo (Chien ir kt., 2016). Tačiau veiksminga strategija būtų nutildyti ROR1 naudojant CRISPR/Cas9, siekiant slopinti TNBC augimą ir metastazes.
Sializacijos procesas apima sialo rūgšties prijungimą prie glikokonjugatų, kurį katalizuoja sialiltransferazės (ST). ST8SIA1 priklauso ST šeimai ir vaidina svarbų vaidmenį įvairių ligų, tokių kaip limfocitinė leukemija ir kolorektalinis vėžys, patogenezėje (Chang ir kt., 2018). RNR sekos analizė rodo, kad ST8SIA1 yra labai ekspresuojamas TNBC pacientų krūties audinyje ir teigiamai koreliuoja su naviko slopintojo geno p53 mutacijomis, kurios gali prisidėti prie TNBC patogenezės (Battula ir kt., 2017). Be to, ST8SIA1 dalyvauja TNBC metastazėse ir atsinaujinime, o tai rodo, kad jis vaidina svarbų vaidmenį TNBC atsiradime ir vystymesi. In vitro TNBC modelyje buvo įrodyta, kad ST8SIA1 slopinimas CRIPSR/Cas9 blokuoja augimą ir metastazes (Battula ir kt., 2017). Tai rodo, kad CRISPR/Cas9 gali būti svarbi priemonė slopinant ST8SIA1 onkogeno funkciją gydant TNBC.
NAT1 yra metabolinis fermentas, katalizuojantis II fazės ksenobiotinių junginių susidarymą ir ekspresuojamas beveik visuose žmogaus audiniuose. NAT1 gali naudoti kofaktorių folatą, kad paveiktų acetil-CoA (acetil-CoA) net ir nesant aromatinio amino substrato (Stepp ir kt., 2015; Laurieri ir kt., 2014). Tyrimai parodė, kad NAT1 reguliuoja matricos metaloproteinazės 9 (MMP9) funkciją krūties vėžio ląstelių modeliuose ir apsaugo nuo reaktyviųjų deguonies formų (ROS) gliukozės badavimo metu (Wang ir kt., 2018). Nustatyta, kad NAT1 ištrynimas slopina piruvato dehidrogenazės kompleksą, o tai sukelia mitochondrijų disfunkciją (Wang L. ir kt., 2019). Be to, įvairiose kitose ataskaitose teigiama, kad NAT1 slopinimas naudojant mažas molekules ir siRNA slopinimą gali sumažinti krūties vėžio ląstelių invazyvumą ir proliferaciją (Stepp ir kt., 2018). Neseniai CRISPR/Cas9 buvo panaudotas NAT1 slopinimui krūties vėžio ląstelių linijoje MDA-MB-231, veikiant ląstelių metabolizmą priklausomai nuo jo raiškos lygio. Šis tyrimas taip pat parodė, kad NAT-1 yra labai svarbus TNBC progresavimui ir metastazėms (Carlisle ir kt., 2020).
Koordinuotą onkogenų transkripciją reguliuoja superstiprintojai, transkripcijos faktoriai ir kofaktoriai (Hnisz ir kt., 2015). Be to, transkripcijos reguliavimui reikalinga grupė ciklino priklausomų kinazių (CDK), tokių kaip CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 ir CDK13. Iš jų CDK7 dalyvauja RNR polimerazės II fosforilinime, kuri yra labai svarbi onkogenų transkripcijos inicijavimui ir plėtrai TNBC patogenezėje. Svarbaus tyrimo metu CDK7 ištrynimas CRISPR/Cas9 metodu slopino TNBC, o tai rodo, kad TNBC patogenezė priklauso nuo CDK7 (Wang Y. ir kt., 2015).
Tyrimai parodė, kad MYC ir RBP (RNR surišančio baltymo) mutacijos gali sukelti apoptozę, o pavienių genų mutacijos MYC arba RBP neturi įtakos vėžio ląstelių augimui (Einstein ir kt., 2021). Naudojant CRISPR/Cas9 pagrįstą biblioteką, buvo ištirta daugiau nei 1000 žmogaus genomo RBP. Iš jų nustatyta, kad 57 RBP yra labai svarbūs vėžio ląstelių, kurių MYC lygis yra labai padidėjęs, augimui (Wheeler ir kt., 2020). Be to, YTHDF2 yra svarbus palaikant TNBC ląstelių augimą ir sumažina metilintų transkriptų kiekį aukšto lygio transkripcijos ir transliacijos metu vėžio ląstelėse, kuriose yra didesnė MYC ekspresija. Be to, YTHDF2 nėra būtinas vėžio ląstelėms, kurios mažiau priklauso nuo padidėjusio MYC lygio, kad pailgintų TNBC pacientų išgyvenamumą (Einstein ir kt., 2021), o tai rodo, kad jis gali būti potencialus terapinis taikinys vaistams, kurie gali įveikti TNBC.
Cinko piršto baltymai (ZNF) sudaro maždaug 1 % viso žmogaus genomo. Tyrimai parodė, kad ZNF gali reguliuoti ląstelių proliferaciją sergant įvairiais vėžio tipais, tokiais kaip kepenų vėžys, krūties vėžys ir kolorektalinis vėžys (Zhang W. ir kt., 2021; Li ir kt., 2017). CRISPR nokautu sukurtos bibliotekos buvo naudojamos įvairiems naviko slopinimo genams (TSG) krūties vėžio ląstelėse tikrinti (Shalem ir kt., 2014). Nuo to laiko atliktas CRISPR/Cas9 ZNF319-deletuotų krūties vėžio ląstelių transkriptominis tyrimas parodė, kad ZNF319 yra naviko slopinimo genas, kuris mažina krūties vėžio proliferaciją ir todėl dalyvauja įvairiuose galimuose signalizacijos mechanizmuose ir kitose biologinėse funkcijose (Wang L. ir kt., 2022).
Feroptozė yra programuojamos ląstelės mirties tipas, priklausantis nuo geležies buvimo. Yra žinoma, kad feroptozės vystymąsi įtakoja lipidų peroksidų buvimas. Be to, pranešta, kad PKCβII pasižymi ankstyva lipidų peroksidacija, o padidėjusi lipidų peroksidacija yra susijusi su feroptoze. CRISPR/Cas9 tarpininkaujamų kinazės inhibitorių bibliotekos atranka parodė, kad PKCβII dalyvauja lipidų peroksidacijos procese, kuris yra labai svarbus feroptozei MDA-MB-231 ląstelėse (Zhang ir kt., 2022). Todėl tai rodo, kad PKCβII išjungimas CRISPR/Cas9 gali būti potencialus naviko slopinimo geno taikinys gydant su feroptoze susijusias ligas (Zhang ir kt., 2022).
Manoma, kad atsparumas vaistams yra maždaug 90 % mirčių nuo vėžio priežastis ir yra vienas iš pagrindinių iššūkių gydant vėžį (Bukowski ir kt., 2020). Rezultatai rodo, kad pakankamas skaičius genų, susijusių su vaistų išstūmimu, DNR atkūrimu, apoptoze ir įvairiais ląstelių signalizacijos keliais, yra susijęs su atsparumu vaistams (Haider ir kt., 2020). Tarp jų keli genai buvo tiriami naudojant CRISPR/Cas9 įrankius ir parodė daug žadančius rezultatus mažinant atsparumą vaistams ir didinant priešvėžinio gydymo veiksmingumą (Vaghari-Tabari ir kt., 2022). Be to, didelio našumo CRISPR/Cas9 genų išjungimo atrankos bibliotekos buvo įtrauktos į galimų atsparumo vaistams genų taikinių funkcijos modifikavimą (Shalem ir kt., 2015). Siekiant nustatyti paklitakselio atsparumo genus, buvo naudojama RNR sekoskaita kartu su viso genomo sgRNR bibliotekos atranka, siekiant nustatyti aštuonis kandidatų genus, įskaitant histono deacetilazę 9 (HDAC9), kurie yra susiję su atsparumu vaistams pacientams, sergantiems pasikartojančiu TNBC (B ir kt., 2020). Kitame tyrime TNBC sergantiems pacientams, gydytiems priešvėžiniais vaistais, išgyvenusiems pacientams buvo pastebėta padidėjusi diserino/treonino ir tirozino proteinkinazės (DSTYK) raiška. Be to, CRISPR/Cas9 sukeltas DSTYK slopinimas reikšmingai sustiprino vaistams atsparių vėžio ląstelių apoptozę in vitro (SUM102PT ląstelės ir MDA-MB-468 ląstelės) ir in vivo TNBC modelyje (Ogbu ir kt., 2021).
Nors TNBC turi nenormalų MAPK kelio aktyvavimą, klinikinis MEK taikinių gydymo poveikis yra silpnas. CRISPR/Cas9 genominės bibliotekos tyrimas parodė, kad PSMG2 (proteomo surinkimo chaperono 2) slopinimas jautrina TNBC BT549 ir ​​MB468 ląsteles MEK inhibitoriui AZD6244. CRISPR/Cas9 sukelto PSMG2 slopinimo metu pasikeitė normali proteasomų funkcija, dėl kurios autofagijos sukeltas PDPK1 išardymas dar labiau pagerino naviko ląsteles TNBC pelių modeliuose, indukuotus AZD6244 (MEK inhibitorius) ir MG132 (proteasomų inhibitorius). Taigi, proteasomų ir MAP kinazės (MEK) inhibitoriai gali būti skiriami sinergiškai, siekiant sumažinti naviko ląstelių proliferaciją (Wang X. ir kt., 2022).
CRISPR/Cas9 taip pat buvo naudojamas genų funkcijos praradimo, sukeliančio TNBC atsparumą, atrankai (Shu ir kt., 2020). Ge ir kt. paaiškino vėžio ląstelių, gydytų JQ1, BET bromodomeno inhibitoriumi (BBDI), atsparumo vaistams mechanizmą TNBC atveju. Naudodami CRISPR/Cas9, jie nustatė, kad rb1 geno ištrynimas sukėlė TNBC atsparumą priešvėžiniam vaistui JQ1. Todėl rb1 funkcija yra svarbi atsakui į JQ1 vaistus TNBC atveju. Jie taip pat pranešė, kad paklitakselis yra CDK4/6 kinazės/mikrovamzdelių inhibitorius, o jo derinys su BBDI, tokiais kaip JQ1, gali suteikti daug žadančio terapinio atsako į vaistams atsparų TNBC (Ge ir kt., 2020).
Pranešta, kad ilgos nekoduojančios RNR (lncRNR) transkripcijos peizažas yra atsakingas už atsparumą neoadjuvantinei terapijai TNBC atveju. Šis tyrimas rodo, kad TNBC yra labai stipriai ekspresuojami penki skirtingi MALAT1 lncRNR transkriptai. Be to, CRISPR/Cas9 sukelta MALAT1 ištrynimas padidino TNBC BT-549 ląstelių jautrumą paklitakseliui ir doksorubicinui, o tai rodo galimą MALAT1 atsparumo vaidmenį TNBC atveju (Shaath ir kt., 2021).
BRCA1 (BRCA1m) mutacijos yra nevienalytės ir todėl jas sunku aptikti. Nukreipimas į PARP1 (poli(ADP-ribozės) polimerazę), sintetinį letalų BRCA1 partnerį, gali padidinti TNBC vaistų chemoterapijos jautrumą. Naudojant CRISPR/Cas9, PARP1 ištrynimas padidino priešvėžinių vaistų, tokių kaip doksorubicinas, gemcitabinas ir docetakselis, jautrumą mBRCA1 mutantinėms TNBC ląstelėms, o tai rodo, kad PARP1 taip pat dalyvauja atsparume vaistams TNBC (Vaghari-Tabari ir kt., 2022). Yra žinoma, kad naviko slopinimo genų BRCA1 arba BRCA2 mutacijos padidina krūties vėžio išsivystymo tikimybę žmonėms. Šių pacientų gydymui reikia vartoti PARP inhibitorius. Be to, buvo įrodyta, kad nukleotidų gelbėjimo faktoriaus DNPH1 išjungimas naudojant CRISPR/Cas9 gali pašalinti toksišką nukleotidą 5-hidroksimetildeoksiuridino (hmdU) monofosfatą, taip padidinant BRCA stokojančių ląstelių atsaką į jautrumą PARP inhibitoriams (Fugger ir kt., 2021). Taigi, CRISPR/Cas9 ir PARP1 inhibitoriai gali tapti svarbia TNBC gydymo strategija.
Penetrantinio glikoproteino (P-gp) genas yra daugelio vaistų atsparumo genas, kurio ekspresija paprastai padidėja maždaug 41 % visų TNBC atvejų (Sun ir kt., 2020). P-gp sukeltas vaistų išstūmimas buvo nustatytas kaip pagrindinis vaistų atsparumo reguliatorius sergant krūties vėžiu. P-gp inhibitoriai parodė padidėjusį jautrumą priešvėžiniams vaistams sergant krūties vėžiu (Famta ir kt., 2021). Taigi, CRISPR/Cas9 tarpininkaujama P-gp ir P-gp inhibitorių abliacija arba slopinimas gali būti labai svarbūs metodai siekiant įveikti vaistų atsparumą TNBC.
Yra žinoma, kad ATP surišantis kasetinis transporteris G2 (ABCG2) sukelia atsparumą vaistams TNBC (Palasuberniam ir kt., 2015), nors šiuo metu nėra pranešimų apie ryšį tarp CRISPR/Cas9 ir ABCG2 nutildymo bei naviko slopinamųjų genų inaktyvacijos. PTEN gali sustiprinti ABCG2 aktyvaciją (Palasuberniam ir kt., 2015), (Deepak Singh ir kt., 2021). Todėl CRISP/Ca9 naudojimas ABCG2 pašalinimui ir jo derinimas su ABCG2 inhibitoriumi gali būti tinkamas gydymas vaistams įveikti TNBC. 2 lentelėje minima, kad CRISPR/Cas9 veikia visus atsparumo genus.
2 lentelė. CRISPR/Cas9 veikia įvairius TNBC atsparumo genus, kad padidintų ląstelių jautrumą priešvėžiniams vaistams.
CRISPR/Cas9 bibliotekos yra potencialūs įrankiai genų mutacijų, susijusių su vėžio patogeneze, atrankai (Chan ir kt., 2022). Šis atrankos metodas apima keturis etapus: (a) bibliotekos sudarymas, (b) lentivirusų transdukcija, (c) fenotipinė atranka ir (d) tikslinių genų analizė. Nors TNBC yra nenormaliai aktyvuotas MAPK kelias, MEK tikslinės terapijos klinikinė prognozė TNBC pacientams, turintiems mutacijas naviko slopinimo genuose, tokiuose kaip PTEN, RB1 ir TP53, yra labai prasta.
Be to, atlikus genų išjungimo tyrimą naudojant CRISPR/Cas9, buvo ištirta stipriausia ir selektyviausia molekulė – dehidrokatrolis, kurio gausu Gvatemalos gėlių ir lapų ekstraktuose, siekiant suprasti dehidrokatrolio poveikį MDA-MB-231. Selektyvaus ląstelių citotoksiškumo mechanizmai. TNBC potipių mezenchiminio kamieniškumo charakteristikos. Šis CRISPR/Cas9 pagrindu atliktas tyrimas taip pat atskleidė, kad HSD17B11, genas, koduojantis 17β-hidroksisteroidų dehidrogenazę 11 tipą, yra labai ekspresuojamas MDA-MB-231 ląstelėse ir lemia MDA-MB-231 ląstelėms būdingą dehidrofalkarinolį (Grant ir kt., 2020). Taigi, tai rodo, kad CRISPR/Cas9 genomo tyrimas turi didelį potencialą nustatant mechanizmus, lemiančius potencialių natūralių junginių priešvėžines savybes.
Be to, TNBC pažeidžiamumas vėžiui buvo tirtas naudojant nešališką viso genomo in vivo CRISPR/Cas9 tyrimą, kuris parodė ryšį tarp onkogeninių ir naviko slopinimo kelių. Pranešta, kad pagrindiniai mTOR ir Hippo kelių komponentai atlieka svarbų vaidmenį naviko reguliavime TNBC. Be to, tyrimai parodė, kad farmakologinis mTORC1/2 ir YAP onkoproteino slopinimas veiksmingai slopina TNBC patogeniškumą, naudojant in vitro vaistų ir matricos sinergijos modelį ir in vivo iš pacientų gautus ksenograftus. Be to, Torin-1 sukeltas mTORC1/2 slopinimas sustiprina makropinocitozę, o verteporfino sukeltas YAP slopinimas sukelia TNBC ląstelių žūtį. Apibendrinus, šie rezultatai pabrėžia viso genomo in vivo CRISPR atrankos galią ir patikimumą nustatant naujus ir veiksmingus TNBC gydymo būdus (Dai ir kt., 2021).
Imuninės sistemos sutrikimai yra svarbus navikų atsiradimo veiksnys. Vėžio ląstelės išvengia imuninio pašalinimo apeidamos gynybos mechanizmus, įskaitant imuninių ląstelių aktyvumo naviko mikroaplinkoje trikdymą ir imuninės sistemos silpninimą. Todėl patobulintos imuninės sistemos sukūrimas gali būti pagrindinis kovos su navikais būdas. CRISPR/Cas9 pagrindu sukurtos genų modifikacijos naudojimas sprendžia kelias su imuninės sistemos disfunkcija susijusias problemas iš skirtingų perspektyvų. CRISPR/Cas9 buvo naudojamas priešnavikiniam imunitetui nuo krūties vėžio pagerinti šiais būdais (3 pav.).
3 pav. CRISPR/Cas9 imunoterapija taikoma TNBC ląstelėms. CDK5 praradimas ir PDL1 bei CD155 slopinimas sustiprina imuninę sistemą. Panašiai A2AR praradimas ir TAA, tokių kaip HER2, mucinas 1 ir TEM8, slopinimas padidino CAR-T ląstelių efektyvumą naikinant vėžio ląsteles. CRISPR/Cas9 sukelta T ląstelių patikra parodė, kad p38 kinazės sutrikdymas sustiprina T ląstelių priešnavikinį aktyvumą. CRISPR/Cas9 modifikuotos T ląstelės padidina TCR (T ląstelių receptoriaus) ekspresiją, todėl T ląstelės pasižymi priešnavikiniu aktyvumu.
Imunoterapijos tikslas – stimuliuoti imuninę sistemą atakuoti vėžio ląsteles. Imuninės kontrolės baltymų perteklinė raiška paprastai užkerta kelią autoimuninėms reakcijoms, tačiau gali padėti vėžiui jų išvengti (Topalian ir kt., 2015). Šie baltymai užkerta kelią imuninėms reakcijoms, prisijungdami prie receptorių imuninių ląstelių paviršiuje. Keli kontroliniai baltymai (pvz., CD155 ir PD-L1) veikia PD-1 receptorių imuninėse ląstelėse ir yra ekspresuojami krūties vėžyje, ypač TNBC (Li Y.-C. ir kt., 2020). PD-L1 arba jo receptoriaus slopinimas naudojant CRISPR/Cas9 gali stimuliuoti imuninę sistemą atakuoti TNBC navikus (Yahata ir kt., 2019). Be to, įrodyta, kad PD-L1 raiškos sumažinimas per CRISPR/Cas9 sukeltą CDK5 ištrynimą slopina naviko augimą in vitro ir in vivo (Deng ir kt., 2020). Augimo slopinimas krūties vėžio in vitro ir in vivo modeliuose rodo, kad shRNR sukeltas CD155 sumažėjimas gali turėti terapinį poveikį krūties vėžiui (Gao ir kt., 2018).
CAR T ląstelės ekspresuoja CAR, kurie atpažįsta su naviku susijusius antigenus (TAA) ir gali panaudoti kontrolinių taškų baltymų slopinimą savo aktyvumui sustiprinti (Li C. ir kt., 2020). Yra įvairių potencialių CAR T ląstelių terapijos taikinių krūties vėžio atveju, įskaitant kelis TAA, tokius kaip HER2, mucin1 ir TEM8 (Bajgain ir kt., 2018). Yra įrodymų, kad CAR T ląstelės, nukreiptos prieš mezoteliną (per daug ekspresuojamos TNBC BT-459 ląstelėse), yra veiksmingesnės prieš vėžį, kai PD-1 yra išjungiamas naudojant CRISPR/Cas9 (Hu ir kt., 2019). Tačiau T ląstelių išskyrimas iš pacientų ir jų redagavimas ex vivo yra daug darbo ir laiko reikalaujantis procesas. Nors universalios T ląstelės gali sumažinti izoliacijos reikalavimus, donorinės T ląstelės, ekspresuojančios žmogaus leukocitų antigeno (HLA) I klasės ir T ląstelių receptorių (TCR), turėtų būti pašalintos, siekiant išvengti transplantato prieš šeimininką anomalijų (Ren ir kt., 2017a). Naudodamas CRISPR/Cas9, HDR gali vienu metu eliminuoti TCR ir HLA bei nokautuoti geną, koduojantį CAR. Tyrimai parodė, kad CRISPR/Cas9 gali būti naudojamas anti-CD19 CAR įvesti į TCR lokusą, tokiu būdu efektyviai gaminant CAR neišeikvojant T ląstelių (Dimitri ir kt., 2022). Buvo sukurtos multipleksinės technologijos, skirtos alogeninėms CAR T ląstelėms generuoti vienu metu eliminuojant TCR, beta-2-mikroglobuliną (B2M), HLA-I subvienetą ir kitus baltymus, tokius kaip PD-1 ir CTLA-4, kurie gali turėti didesnių priešvėžinių savybių prieš TNBC (Eyquem ir kt., 2017; Liu ir kt., 2017; Ren ir kt., 2017b; Dimitri ir kt., 2022).
CRISPR/Cas9 naudojimas galėtų pagerinti CAR-T ląstelių efektyvumą. Yra žinoma, kad adenozinas pasižymi imunosupresinėmis savybėmis ir gali sumažinti priešvėžinį imunitetą, blokuodamas T ląstelių funkciją ir aktyvuodamas adenozino A2A receptorius (A2AR) (Vigano ir kt., 2019). A2AR nutildymas naudojant CRISPR/Cas9 žymiai pagerino CAR-T ląstelių efektyvumą in vivo (Giuffrida ir kt., 2021). Yra žinoma, kad T ląstelės pasižymi įvairiomis fenotipinėmis savybėmis, tokiomis kaip ląstelių ekspansija, diferenciacija, oksidacinis stresas ir genominis stresas. CRISPR/Cas9 pagrindu atliktas T ląstelių patikrinimas atskleidė 25 skirtingų T ląstelių receptorių kinazių sutrikimą. Tarp jų, p38 kinazės ištrynimas sustiprina T ląstelių priešnavikinį aktyvumą, o tai rodo, kad p38 kinazė yra pagrindinis CAR-T ląstelių reguliavimo reguliatorius (Gurusamy ir kt., 2020).
T ląsteles galima genetiškai modifikuoti naudojant CRISPR/Cas9, kad būtų gautos labai ekspresuojamos T ląstelės (TCR). Genetiškai modifikuotų T ląstelių perkėlimas pacientams parodė stipresnį priešvėžinį aktyvumą nei endogeninių T ląstelių. Todėl endogeninės T ląstelės gali konkuruoti su genetiškai pakeistomis T ląstelėmis pacientų organizme, o tai gali turėti įtakos vėžio imunoterapijos potencialui. Siekiant išspręsti šią problemą, naudojant CRISPR/Cas9 endogeninėms TCR-β ląstelėms pašalinti recipiento ląstelėse ir vėliau perkeliant TCR-β T ląsteles vėžiu sergantiems pacientams, galima pasižymėti geresniu priešvėžiniu imuniniu atsaku, nereikalaujant endogeninių TCR lytinės konkurencijos (Fan ir kt., 2018). Taigi, išskyrus CRISPR modifikuotas T ląsteles, TCR yra tūkstantį kartų jautresnės naviko antigenams nei įprastos TCR transdukuotos T ląstelės. Be to, sergant įvairiomis leukemijomis, γδ TCR+ CRISPR generuojamos pakeistos T ląstelės pasižymi didesne CD4+ ir CD8+ T ląstelių raiška nei standartinis TCR perkėlimas (Legut ir kt., 2018). Taigi, modifikuotos T ląstelės, generuojamos CRISPR/Cas9, gali būti veiksmingas imunoterapijos metodas, skirtas įveikti TNBC.
Integrinai yra ląstelių adhezijos molekulės, esančios ląstelių transmembranose ir skatinančios ląstelių prisijungimą prie tarpląstelinės matricos (ECM) (Hamidi ir Ivaska, 2018). Integrinų disreguliacija yra susijusi su vėžio vystymusi ir migracija, pakeičiant tarpląstelinę matricą, dėl ko vėžio ląstelės išgyvena kraujyje (Hamidi ir Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9 tarpininkaujantis integrinų slopinimas sulėtina naviko progresavimą, metastazes ir kolonizaciją TNBC. Pranešta, kad integrino α5 (ITGA5) slopinimas sumažina ląstelių migraciją ir progresavimą kitų rūšių vėžiuose, tokiuose kaip plaučių vėžys (Ju ir kt., 2017), o tai rodo, kad integrinas α5 taip pat gali būti pagrindinis TNBC patogenezės veiksnys.
Pelių be genotipo generavimas naudojant tradicinius embrioninių kamieninių (ES) ląstelių metodus yra daug darbo reikalaujantis, daug laiko ir neefektyvus procesas. Prireikia mėnesių ir metų, kol ES ląstelės bus nukreiptos homologiškos rekombinacijos būdu, išvedamos chimerinės pelės, o vėliau jos sukryžminamos su heterozigotinėmis pelėmis, kad būtų gauti homozigotiniai palikuonys. Norint sukurti peles su keliomis genetinėmis mutacijomis, reikalingas sudėtingas kryžminimas. Tačiau naudojant peles, gautas pašalinant ES ląsteles naudojant CRISPR/Cas9 arba mikroinjekcuojant CRISPR/Cas9 komponentus į apvaisintus vienaląsčius kiaušinėlius, iškilo daug problemų. Pavyzdžiui, pokyčiai dažnai įvyksta dvialelinėse vietose ir nėra specifiniai genams. Neseniai buvo pranešta, kad ES ląstelės, naudojant CRISPR/Cas9 technologiją, gali vienu metu įterpti dvialeles mutacijas iki 5 genų (Nishizono ir kt., 2021). Šiuo tikslu į ES ląsteles vienu metu buvo transfekuotos Cas9 mRNR ir penkios genams specifinės gRNR. Tai pabrėžia šios procedūros perspektyvumą ir efektyvumą, nors šios mutacijos galėjo būti perduodamos, kai buvo veisiamos pradinės linijos, siekiant gauti penkiagubas pelių be genotipo generatorius. Tyrime taip pat pranešama apie stebinantį atradimą: ES ląstelės nebėra reikalingos genetiškai modifikuotoms pelėms sukurti. Vietoj to, siekiant pašalinti specifinius genų produktus, į vienaląsčius embrionus buvo sušvirkšta Cas9 mRNR ir gRNR. Dėl to buvo sukurtos „knockout“ pradinės linijos, kurias teoriškai galima naudoti tiriant genų delecijos pasekmes pelėms (Qin ir kt., 2016). Taigi, CRISPR/Cas9 leidžia sukurti transgenines peles, skirtas TNBC gydyti mažesnėmis sąnaudomis nei tradicinė genų inžinerija. Naudojant CRISPR/Cas sistemą, buvo sukurtas naujas „knockout“ pelių modelis, kuris gali sėkmingai įvesti taškines mutacijas viename ar keliuose endogeniniuose TNBC genuose. Remiantis šia koncepcija, TNBC gyvūnų modeliai taip pat gali būti sukurti naudojant CRISPR/Cas9 sukeltą BRCA1 ir p53 deleciją, dėl kurios prarandamas HR atkūrimas, atsiranda genomo nestabilumas ir mutantiniai fenotipai (Annunziato ir kt., 2020).
Šiuo metu TNBC diagnozavimui naudojami įvairūs metodai, tokie kaip mamografija, magnetinio rezonanso tomografija (MRT) ir ultragarsas. Tačiau šie metodai turi tam tikrų apribojimų. Mamografija naudojama vietiniam krūties audiniui, o ne metastazėms, kai vėžio ląstelės migravo į kitus organus, diagnozuoti. Ultragarsas nėra patikimas TNBC diagnozavimo metodas (Chen ir Lee-Felker, 2023). MRT jautrumas yra didesnis nei ultragarsas ir mamografija, tačiau jo diagnostinis tikslumas yra ribotas (Sha ir Chen, 2022). Audinių biopsija yra invazinis būdas vėžinėms ląstelėms nustatyti. Tačiau kai kuriais atvejais biopsija gali neaptikti vėžinio audinio, jei adata nukrypsta nuo dominančios srities. Be to, tai labai brangu ir gali būti traumuojanti pacientui. TNBC yra heterogeniškas vėžio tipas, todėl biopsija gali nesuteikti pakankamai informacijos apie vėžio tipą. Todėl skubiai reikalingas naujas diagnostiškai patikimas TNBC nustatymo metodas. CRISPR/Cas9 gali būti labai jautri ir minimaliai invazinė alternatyva krūties vėžio diagnozei. Šiuo tikslu CRISPR/Cas9 pagrįstos strategijos gali būti naudojamos PGR metodams, skirtiems TNBC diagnozei pagerinti. Pirma, CRISPR sistemos Cas9 ir cpf1 baltymai naudojami nespecifinei DNR pašalinti, o tada šie du baltymai (Cas9 ir cpf1) gali atpažinti PAM seką prieš prisijungdami prie tikslinės DNR (Deepak Singh ir kt., 2021). Taigi, PGR gali nustatyti su vėžio vystymusi susijusias mutacijas. Keli tyrimai pritaikė šią CRISPR pagrįstą strategiją skirtingoms mutacijoms aptikti skirtinguose vėžiuose (Safari ir kt., 2019). Taigi, CRISPR pagrįsti PGR metodai gali sumažinti TNBC diagnozės priklausomybę nuo invazinių metodų, tokių kaip biopsija pagrįsta imunohistochemija.
Genotipiniai hormonų receptorių reguliacijos pokyčiai taip pat buvo nustatyti TNBC atveju (Chen ir Russo, 2009). CRISPR/Cas9 pagrįstos PGR strategijos, naudojant mikrogardelius diagnostikai gydymo vietoje, gali veiksmingai stebėti šias mutacijas (Hajian ir kt., 2019). Tai taip pat galėtų suteikti sveikatos priežiūros paslaugų teikėjams aktualios informacijos apie specifines mutacijas TNBC pacientams, o tai galėtų padėti pagerinti jų gydymo eigą. Tačiau ši kombinuota technika turi apribojimų. Todėl prieš pradedant naudoti šį CRISPR/Cas-PGR metodą sveikatos priežiūros srityje TNBC diagnozei, reikia atlikti išsamius tyrimus (Yang ir kt., 2019).