Diferencinė kompiuterinės tomografijos (KT) būdu nustatytų plaučių mazgų diagnostika išlieka iššūkiu klinikinėje praktikoje.Čia apibūdiname pasaulinį 480 serumo mėginių metabolomą, įskaitant sveiką kontrolę, gerybinius plaučių mazgus ir I stadijos plaučių adenokarcinomą.Adenokarcinomos pasižymi unikaliais metabolominiais profiliais, o gerybiniai mazgeliai ir sveiki asmenys turi didelį metabolominių profilių panašumą.Atradimų grupėje (n = 306) buvo nustatytas 27 metabolitų rinkinys, atskiriantis gerybinius ir piktybinius mazgus.Diskriminuojančio modelio AUC vidinio patvirtinimo (n = 104) ir išorinio patvirtinimo (n = 111) grupėse buvo atitinkamai 0,915 ir 0,945.Kelio analizė atskleidė padidėjusį glikolitinių metabolitų kiekį, susijusį su sumažėjusiu triptofano kiekiu plaučių adenokarcinomos serume, palyginti su gerybiniais mazgeliais ir sveikomis kontrolėmis, ir pasiūlė, kad triptofano įsisavinimas skatina glikolizę plaučių vėžio ląstelėse.Mūsų tyrimas pabrėžia serumo metabolitų biomarkerių reikšmę vertinant KT aptiktų plaučių mazgų riziką.
Ankstyva diagnozė yra labai svarbi siekiant pagerinti vėžiu sergančių pacientų išgyvenamumą.JAV Nacionalinio plaučių vėžio atrankos tyrimo (NLST) ir Europos NELSON tyrimo rezultatai parodė, kad atranka naudojant mažos dozės kompiuterinę tomografiją (LDCT) gali žymiai sumažinti mirtingumą nuo plaučių vėžio didelės rizikos grupėse1,2,3.Nuo tada, kai LDCT buvo plačiai naudojamas atliekant plaučių vėžio patikrą, atsitiktinių radiografinių tyrimų, susijusių su besimptomiais plaučių mazgeliais, dažnis ir toliau didėjo 4 .Plaučių mazgai apibrėžiami kaip židinio neskaidrumas iki 3 cm skersmens 5 .Mums sunku įvertinti piktybinių navikų tikimybę ir susidoroti su dideliu LDCT atsitiktinai aptiktų plaučių mazgų skaičiumi.KT apribojimai gali lemti dažnus tolesnius tyrimus ir klaidingai teigiamus rezultatus, o tai gali sukelti nereikalingą įsikišimą ir pernelyg didelį gydymą6.Todėl reikia sukurti patikimus ir naudingus biologinius žymenis, kad būtų galima teisingai nustatyti plaučių vėžį ankstyvosiose stadijose ir atskirti daugumą gerybinių mazgų pradinio aptikimo metu 7 .
Išsami kraujo (serumo, plazmos, periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių) molekulinė analizė, įskaitant genomiką, proteomiką ar DNR metilinimą8, 9, 10, paskatino vis didesnį susidomėjimą plaučių vėžio diagnostinių biomarkerių atradimu.Tuo tarpu metabolomikos metodai matuoja ląstelių galutinius produktus, kuriems įtakos turi endogeniniai ir egzogeniniai veiksmai, todėl jie naudojami prognozuojant ligos pradžią ir baigtį.Skysčių chromatografijos tandeminė masės spektrometrija (LC-MS) yra plačiai naudojamas metabolomikos tyrimų metodas dėl didelio jautrumo ir didelio dinaminio diapazono, kuris gali apimti metabolitus, turinčius skirtingas fizikines ir chemines savybes11, 12, 13.Nors pasaulinė plazmos / serumo metabolominė analizė buvo naudojama siekiant nustatyti biologinius žymenis, susijusius su plaučių vėžio diagnoze 14, 15, 16, 17 ir gydymo veiksmingumu, 18 serumo metabolitų klasifikatoriai, skirti atskirti gerybinius ir piktybinius plaučių mazgus, dar turi būti daug ištirti.- masiniai tyrimai.
Adenokarcinoma ir plokščialąstelinė karcinoma yra du pagrindiniai nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (NSCLC) potipiai.Įvairūs KT atrankos testai rodo, kad adenokarcinoma yra labiausiai paplitęs histologinis plaučių vėžio tipas1,19,20,21.Šiame tyrime naudojome itin efektyvią skysčių chromatografiją ir didelės skiriamosios gebos masių spektrometriją (UPLC-HRMS), kad atliktume metabolomikos analizę iš viso 695 serumo mėginiuose, įskaitant sveiką kontrolę, gerybinius plaučių mazgus ir KT aptiktus ≤3 cm.I stadijos plaučių adenokarcinomos patikra.Mes nustatėme serumo metabolitų grupę, kuri išskiria plaučių adenokarcinomą nuo gerybinių mazgų ir sveikų kontrolinių grupių.Kelio praturtinimo analizė atskleidė, kad nenormalus triptofano ir gliukozės metabolizmas yra dažni plaučių adenokarcinomos pokyčiai, palyginti su gerybiniais mazgeliais ir sveika kontrole.Galiausiai sukūrėme ir patvirtinome didelio specifiškumo ir jautrumo serumo metabolinį klasifikatorių, kad atskirtume piktybinius ir gerybinius plaučių mazgus, aptiktus LDCT, o tai gali padėti atlikti ankstyvą diferencinę diagnozę ir įvertinti riziką.
Šiame tyrime lytį ir amžių atitinkantys serumo mėginiai buvo retrospektyviai paimti iš 174 sveikų kontrolinių asmenų, 292 pacientų su gerybiniais plaučių mazgeliais ir 229 pacientų, sergančių I stadijos plaučių adenokarcinoma.695 tiriamųjų demografinės charakteristikos pateiktos 1 papildomoje lentelėje.
Kaip parodyta 1a paveiksle, Sun Yat-sen universiteto vėžio centre buvo paimta iš viso 480 serumo mėginių, įskaitant 174 sveikų kontrolinių (HC), 170 gerybinių mazgų (BN) ir 136 I stadijos plaučių adenokarcinomos (LA) mėginių.Atradimų grupė, skirta netikslingam metabolominiam profiliavimui naudojant itin efektyvią skysčių chromatografiją – didelės skiriamosios gebos masių spektrometriją (UPLC-HRMS).Kaip parodyta 1 papildomame paveiksle, buvo nustatyti skirtingi LA ir HC, LA ir BN metabolitai, siekiant sukurti klasifikavimo modelį ir toliau tirti diferencinio kelio analizę.104 mėginiai, surinkti Sun Yat-sen universiteto vėžio centre, ir 111 mėginių, surinktų dviejose kitose ligoninėse, buvo atitinkamai patvirtinti viduje ir išorėje.
Tyrimo populiacija atradimų grupėje, kuriai buvo atlikta pasaulinė serumo metabolomikos analizė, naudojant itin efektyvią skysčių chromatografiją ir didelės skiriamosios gebos masių spektrometriją (UPLC-HRMS).b Dalinės mažiausių kvadratų diskriminacinė analizė (PLS-DA) iš viso metabolomo iš 480 serumo mėginių iš tyrimo kohortos, įskaitant sveiką kontrolę (HC, n = 174), gerybinius mazgus (BN, n = 170) ir I stadijos plaučių adenokarcinomą. (Los Andželas, n = 136).+ESI, teigiamas elektropurškimo jonizacijos režimas, -ESI, neigiamas elektropurškimo jonizacijos režimas.c–e Metabolitai, kurių gausa labai skiriasi dviejose nurodytose grupėse (dviejų uodegų Vilkoksono ženklo testas, klaidingai aptikimo dažnis pakoreguota p vertė, FDR <0,05), rodomi raudonai (karto pokytis > 1,2) ir mėlynai (karto pokytis < 0,83). .), parodyta ugnikalnio grafike.f Hierarchinis klasterizacijos šilumos žemėlapis, rodantis reikšmingus anotuotų metabolitų skaičiaus skirtumus tarp LA ir BN.Pirminiai duomenys pateikiami šaltinių duomenų failų forma.
Bendras 174 HC, 170 BN ir 136 LA metabolomas serume atradimo grupėje buvo ištirtas naudojant UPLC-HRMS analizę.Pirmiausia parodome, kad kokybės kontrolės (QC) mėginiai glaudžiai susitelkę neprižiūrimo pagrindinių komponentų analizės (PCA) modelio centre, patvirtindami dabartinio tyrimo atlikimo stabilumą (2 papildomas paveikslas).
Kaip parodyta dalinės mažiausių kvadratų diskriminacinės analizės (PLS-DA) 1b paveiksle, mes nustatėme, kad buvo aiškūs skirtumai tarp LA ir BN, LA ir HC teigiamuose (+ESI) ir neigiamuose (-ESI) elektropurškimo jonizacijos režimuose. .izoliuotas.Tačiau reikšmingų skirtumų tarp BN ir HC +ESI ir -ESI sąlygomis nenustatyta.
Mes nustatėme 382 skirtumus tarp LA ir HC, 231 skirtingą požymį tarp LA ir BN ir 95 skirtumus tarp BN ir HC (Wilcoxon signed rango testas, FDR <0,05 ir daugkartinis pokytis >1,2 arba <0,83) (.1c-e pav. )..Smailės buvo toliau anotuotos (3 papildomi duomenys) pagal duomenų bazę (mzCloud / HMDB / Chemspider biblioteką) pagal m / z vertę, sulaikymo laiką ir suskaidymo masės spektro paiešką (išsami informacija aprašyta metodų skyriuje) 22 .Galiausiai buvo nustatyti 33 ir 38 anotuoti metabolitai, kurių gausa labai skiriasi LA ir BN (1f pav. ir 2 papildoma lentelė) ir LA, palyginti su HC (papildomas 3 paveikslas ir 2 papildoma lentelė).Priešingai, BN ir HC buvo nustatyti tik 3 metabolitai, kurių gausa labai skiriasi (2 papildoma lentelė), o tai atitinka BN ir HC sutapimą PLS-DA.Šie skirtingi metabolitai apima daugybę biocheminių medžiagų (papildomas 4 paveikslas).Visi šie rezultatai rodo reikšmingus serumo metabolomo pokyčius, kurie atspindi piktybinę ankstyvos stadijos plaučių vėžio transformaciją, palyginti su gerybiniais plaučių mazgeliais ar sveikais asmenimis.Tuo tarpu BN ir HC serumo metabolizmo panašumas rodo, kad gerybiniai plaučių mazgeliai gali turėti daug biologinių savybių su sveikais asmenimis.Atsižvelgiant į tai, kad epidermio augimo faktoriaus receptorių (EGFR) geno mutacijos yra dažnos 23 potipio plaučių adenokarcinomos atveju, siekėme nustatyti vairuotojų mutacijų įtaką serumo metabolizmui.Tada išanalizavome bendrą 72 atvejų, turinčių EGFR būklę, metabolinį profilį plaučių adenokarcinomos grupėje.Įdomu tai, kad PCA analizėje radome palyginamus profilius tarp EGFR mutantų pacientų (n = 41) ir EGFR laukinio tipo pacientų (n = 31) (papildomas 5a paveikslas).Tačiau mes nustatėme 7 metabolitus, kurių gausa reikšmingai pakito pacientams, sergantiems EGFR mutacija, palyginti su pacientais, sergančiais laukinio tipo EGFR (t testas, p < 0, 05 ir kartotinis pokytis > 1, 2 arba < 0, 83) (papildomas 5b paveikslas).Dauguma šių metabolitų (5 iš 7) yra acilkarnitinai, kurie atlieka svarbų vaidmenį riebalų rūgščių oksidacijos keliuose.
Kaip parodyta 2a paveiksle parodytoje darbo eigoje, mazgelių klasifikavimo biomarkeriai buvo gauti naudojant mažiausio absoliutaus susitraukimo operatorius ir atranką pagal 33 skirtingus metabolitus, nustatytus LA (n = 136) ir BN (n = 170).Geriausias kintamųjų derinys (LASSO) – dvejetainės logistinės regresijos modelis.Dešimties kartų kryžminis patvirtinimas buvo naudojamas modelio patikimumui patikrinti.Kintamojo pasirinkimas ir parametrų reguliavimas koreguojamas tikimybės maksimizavimo bauda su parametru λ24.Visuotinė metabolomikos analizė toliau buvo atliekama nepriklausomai vidinės (n = 104) ir išorinio patvirtinimo (n = 111) grupėse, siekiant patikrinti diskriminuojančio modelio klasifikavimo efektyvumą.Dėl to 27 metabolitai atradimų rinkinyje buvo nustatyti kaip geriausias diskriminacinis modelis, turintis didžiausią vidutinę AUC vertę (2b pav.), iš kurių 9 buvo padidėjęs aktyvumas ir 18 sumažėjęs LA aktyvumas, palyginti su BN (2c pav.).
Plaučių mazgelių klasifikatoriaus kūrimo darbo eiga, įskaitant geriausios serumo metabolitų grupės parinkimą atradimo rinkinyje, naudojant dvejetainį logistinės regresijos modelį, taikant dešimt kartų kryžminį patvirtinimą, ir nuspėjamojo veikimo įvertinimą vidiniuose ir išoriniuose patvirtinimo rinkiniuose.b LASSO regresijos modelio kryžminio patvirtinimo statistika metabolinių biomarkerių atrankai.Aukščiau pateikti skaičiai rodo vidutinį biomarkerių, pasirinktų tam tikru λ, skaičių.Raudona punktyrinė linija rodo vidutinę AUC vertę atitinkamoje lambda.Pilkos klaidų juostos rodo mažiausią ir didžiausią AUC reikšmes.Taškinė linija rodo geriausią modelį su 27 pasirinktais biologiniais žymenimis.AUC, plotas po imtuvo veikimo charakteristikų (ROC) kreive.c Sumažinkite 27 pasirinktų metabolitų pokyčius LA grupėje, palyginti su BN grupe atradimų grupėje.Raudonas stulpelis – aktyvinimas.Mėlyna stulpelis yra nuosmukis.d–f Imtuvo veikimo charakteristikų (ROC) kreivės, rodančios diskriminuojančio modelio galią, pagrįstą 27 metabolitų deriniais atradimo, vidinio ir išorinio patvirtinimo rinkiniuose.Pirminiai duomenys pateikiami šaltinių duomenų failų forma.
Numatymo modelis buvo sukurtas remiantis šių 27 metabolitų svertiniais regresijos koeficientais (3 papildoma lentelė).ROC analizė, pagrįsta šiais 27 metabolitais, davė ploto po kreive (AUC) reikšmę 0,933, atradimo grupės jautrumas buvo 0,868, o specifiškumas – 0,859 (2d pav.).Tuo tarpu tarp 38 anotuotų skirtingų metabolitų tarp LA ir HC 16 metabolitų rinkinys pasiekė AUC 0, 902, kurių jautrumas 0, 801 ir specifiškumas 0, 856, atskiriant LA nuo HC (papildomas 6a-c paveikslas).Taip pat buvo palygintos AUC vertės, pagrįstos skirtingomis skirtingų metabolitų kartojimo slenksčiais.Mes nustatėme, kad klasifikavimo modelis geriausiai sekėsi atskirti LA ir BN (HC), kai buvo nustatytas 1, 2, palyginti su 1, 5 arba 2, 0 (papildomas 7a, b paveikslas).Klasifikavimo modelis, pagrįstas 27 metabolitų grupėmis, buvo toliau patvirtintas vidinėse ir išorinėse grupėse.AUC buvo 0,915 (jautrumas 0,867, specifiškumas 0,811) vidiniam patvirtinimui ir 0,945 (jautrumas 0,810, specifiškumas 0,979) išoriniam patvirtinimui (2e, f pav.).Siekiant įvertinti tarplaboratorinį efektyvumą, 40 mėginių iš išorinės kohortos buvo ištirta išorinėje laboratorijoje, kaip aprašyta skyriuje Metodai.Klasifikavimo tikslumas pasiekė AUC 0,925 (papildomas 8 paveikslas).Kadangi plaučių plokščialąstelinė karcinoma (LUSC) yra antras labiausiai paplitęs nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (NSCLC) potipis po plaučių adenokarcinomos (LUAD), mes taip pat išbandėme patvirtintą galimą metabolinių profilių naudingumą.BN ir 16 LUSC atvejų.LUSC ir BN diskriminacijos AUC buvo 0, 776 (papildomas 9 paveikslas), o tai rodo prastesnį gebėjimą, palyginti su LUAD ir BN diskriminacija.
Tyrimai parodė, kad mazgų dydis KT vaizduose teigiamai koreliuoja su piktybinių navikų tikimybe ir išlieka pagrindiniu mazgelių gydymo veiksniu25, 26, 27.Didelės NELSON atrankos tyrimo grupės duomenų analizė parodė, kad piktybinių navikų rizika tiriamiesiems, kurių mazgai < 5 mm, buvo netgi panaši į tiriamųjų be mazgų28.Todėl mažiausias dydis, reikalaujantis reguliaraus KT stebėjimo, yra 5 mm, kaip rekomenduoja Britanijos krūtinės ląstos draugija (BTS), ir 6 mm, kaip rekomenduoja Fleischnerio draugija 29 .Tačiau didesni nei 6 mm mazgeliai be akivaizdžių gerybinių požymių, vadinami neapibrėžtais plaučių mazgeliais (IPN), išlieka pagrindiniu klinikinės praktikos įvertinimo ir valdymo iššūkiu30, 31.Toliau ištyrėme, ar mazgo dydis paveikė metabolominius parašus, naudodamiesi jungtiniais mėginiais iš atradimo ir vidinių patvirtinimo grupių.Sutelkdami dėmesį į 27 patvirtintus biomarkerius, pirmiausia palyginome HC ir BN sub-6 mm metabolomų PCA profilius.Mes nustatėme, kad dauguma HC ir BN duomenų sutapo, o tai rodo, kad metabolitų kiekis serume buvo panašus abiejose grupėse (3a pav.).Įvairių dydžių diapazonų ypatybių žemėlapiai išliko išsaugoti BN ir LA (3b pav., c), o piktybiniai ir gerybiniai mazgeliai buvo atskirti 6–20 mm diapazone (3d pav.).Šios kohortos AUC buvo 0,927, specifiškumas – 0,868, o jautrumas – 0,820, numatant 6–20 mm dydžio mazgų piktybiškumą (3e, f pav.).Mūsų rezultatai rodo, kad klasifikatorius gali užfiksuoti metabolinius pokyčius, kuriuos sukelia ankstyva piktybinė transformacija, neatsižvelgiant į mazgelių dydį.
ad PCA profilių palyginimas tarp nurodytų grupių, remiantis 27 metabolitų metaboliniu klasifikatoriumi.CC ir BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.LA 6–20 mm, palyginti su LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm ir LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Imtuvo veikimo charakteristikų (ROC) kreivė, rodanti diskriminacinio modelio veikimą 6–20 mm mazgeliams.f Tikimybių reikšmės buvo apskaičiuotos remiantis logistinės regresijos modeliu mazgeliams, kurių matmenys 6–20 mm.Pilka punktyrinė linija rodo optimalią ribinę vertę (0,455).Aukščiau pateikti skaičiai rodo Los Andžele numatytų atvejų procentą.Naudokite dviejų krypčių Studento t testą.PCA, pagrindinių komponentų analizė.AUC plotas po kreive.Pirminiai duomenys pateikiami šaltinių duomenų failų forma.
Taip pat buvo atrinkti keturi mėginiai (44–61 metų amžiaus), kurių plaučių mazgų dydis buvo panašus (7–9 mm), siekiant iliustruoti siūlomo piktybinių navikų prognozės modelio veikimą (4a, b pav.).Pirminės patikros metu 1 atvejis buvo parodytas kaip tvirtas mazgelis su kalcifikacija, ypatybe, susijusia su gerybiškumu, o 2 atvejis buvo pateiktas kaip neapibrėžtas iš dalies kietas mazgelis, neturintis jokių akivaizdžių gerybinių požymių.Trys tolesnių KT skenavimo etapai parodė, kad šie atvejai išliko stabilūs per 4 metus, todėl buvo laikomi gerybiniais mazgeliais (4a pav.).Palyginti su klinikiniu serijinių KT nuskaitymų vertinimu, vieno kadro serumo metabolitų analizė naudojant dabartinį klasifikatoriaus modelį greitai ir teisingai nustatė šiuos gerybinius mazgus, remiantis tikimybiniais apribojimais (1 lentelė).4b paveiksle 3 atveju pavaizduotas mazgas su pleuros atitraukimo požymiais, kurie dažniausiai siejami su piktybiniais navikais32.4 atvejis pateiktas kaip neapibrėžtas iš dalies kietas mazgas, neturintis gerybinės priežasties.Visi šie atvejai buvo numatyti kaip piktybiniai pagal klasifikatoriaus modelį (1 lentelė).Plaučių adenokarcinomos įvertinimą įrodė histopatologinis tyrimas po plaučių rezekcijos operacijos (4b pav.).Išoriniam patvirtinimo rinkiniui metabolinis klasifikatorius tiksliai numatė du neapibrėžtų plaučių mazgų, didesnių nei 6 mm, atvejus (papildomas 10 paveikslas).
Dviejų gerybinių mazgų atvejų plaučių ašinio lango KT vaizdai.1 atveju kompiuterinė tomografija po 4 metų parodė stabilų kietą 7 mm mazgą su kalcifikacija dešinėje apatinėje skiltyje.2 atveju kompiuterinė tomografija po 5 metų atskleidė stabilų, iš dalies tvirtą 7 mm skersmens mazgą dešinėje viršutinėje skiltyje.b Plaučių ašinio lango KT vaizdai ir atitinkami patologiniai dviejų I stadijos adenokarcinomos atvejų tyrimai prieš plaučių rezekciją.3 atvejis atskleidė 8 mm skersmens mazgelį dešinėje viršutinėje skiltyje su pleuros atitraukimu.4 atvejis atskleidė iš dalies tvirtą šlifuoto stiklo mazgą, kurio matmenys buvo 9 mm kairiojoje viršutinėje skiltyje.Rezekuoto plaučių audinio dažymas hematoksilinu ir eozinu (H&E) (skalės juosta = 50 μm), parodantis plaučių adenokarcinomos acinarinį augimo modelį.Rodyklės rodo KT vaizduose aptiktus mazgus.H&E vaizdai yra reprezentatyvūs kelių (> 3) mikroskopinių laukų, kuriuos ištyrė patologas, vaizdai.
Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo galimą serumo metabolitų biomarkerių vertę diferencinėje plaučių mazgelių diagnostikoje, o tai gali kelti iššūkių vertinant KT patikrą.
Remdamiesi patvirtinta diferencijuota metabolitų grupe, siekėme nustatyti pagrindinių metabolinių pokyčių biologines koreliacijas.MetaboAnalyst atlikta KEGG kelio praturtinimo analizė nustatė 6 bendrus reikšmingai pakitusius kelius tarp dviejų nurodytų grupių (LA vs. HC ir LA vs. BN, pakoreguotas p ≤ 0,001, poveikis > 0,01).Šie pokyčiai pasižymėjo piruvato, triptofano, niacino ir nikotinamido metabolizmo, glikolizės, TCA ciklo ir purino metabolizmo sutrikimais (5a pav.).Tada mes toliau atlikome tikslinę metabolomiką, kad patikrintume pagrindinius pokyčius naudodami absoliutų kiekybinį nustatymą.Įprastų metabolitų nustatymas dažniausiai keičiamuose keliuose trigubo kvadrupolio masės spektrometrija (QQQ), naudojant autentiškus metabolitų standartus.Metabolomikos tyrimo tikslinio mėginio demografinės charakteristikos įtrauktos į 4 papildomą lentelę. Remiantis mūsų visuotiniais metabolomikos rezultatais, kiekybinė analizė patvirtino, kad hipoksantino ir ksantino, piruvato ir laktato kiekis LA padidėjo, palyginti su BN ir HC (5b, c pav., p <0,05).Tačiau reikšmingų šių metabolitų skirtumų tarp BN ir HC nenustatyta.
KEGG kelio praturtinimo analizė labai skirtingiems metabolitams LA grupėje, palyginti su BN ir HC grupėmis.Buvo naudojamas dviejų krypčių Globaltestas, o p vertės buvo koreguojamos Holm-Bonferroni metodu (pakoreguota p ≤ 0,001 ir efekto dydis > 0,01).b–d Smuiko diagramos, rodančios hipoksantino, ksantino, laktato, piruvato ir triptofano koncentraciją serume HC, BN ir LA, nustatytas LC-MS/MS (n = 70 grupėje).Baltos ir juodos punktyrinės linijos rodo atitinkamai medianą ir kvartilį.e Smuiko diagrama, rodanti normalizuotą Log2TPM (transkriptai milijonui) SLC7A5 ir QPRT mRNR ekspresiją sergant plaučių adenokarcinoma (n = 513), palyginti su normaliu plaučių audiniu (n = 59) LUAD-TCGA duomenų rinkinyje.Baltas langelis žymi tarpkvartilinį diapazoną, horizontali juoda linija centre – medianą, o vertikali juoda linija, besitęsianti nuo langelio, reiškia 95 % pasikliautinąjį intervalą (PI).f SLC7A5 ir GAPDH ekspresijos Pirsono koreliacijos grafikas sergant plaučių adenokarcinoma (n = 513) ir normaliu plaučių audiniu (n = 59) TCGA duomenų rinkinyje.Pilka sritis reiškia 95 % PI.r, Pearsono koreliacijos koeficientas.g Normalizuoti ląstelių triptofano kiekiai A549 ląstelėse, transfekuotose nespecifine shRNR kontrole (NC) ir shSLC7A5 (Sh1, Sh2), nustatyta LC-MS/MS.Pateikta penkių biologiškai nepriklausomų mėginių kiekvienoje grupėje statistinė analizė.h Ląstelių NADt lygiai (bendras NAD, įskaitant NAD+ ir NADH) A549 ląstelėse (NC) ir SLC7A5 numušamose A549 ląstelėse (Sh1, Sh2).Pateikta trijų biologiškai nepriklausomų mėginių kiekvienoje grupėje statistinė analizė.i A549 ląstelių glikolitinis aktyvumas prieš ir po SLC7A5 numušimo buvo matuojamas ekstraląstelinio rūgštėjimo greičiu (ECAR) (n = 4 biologiškai nepriklausomi mėginiai vienoje grupėje).2-DG,2-deoksi-D-gliukozė.Dviejų uodegų Studento t testas buvo naudojamas (b–h).(g – i) klaidų juostos rodo vidurkį ± SD, kiekvienas eksperimentas buvo atliktas tris kartus nepriklausomai, o rezultatai buvo panašūs.Pirminiai duomenys pateikiami šaltinių duomenų failų forma.
Atsižvelgdami į reikšmingą pakitusio triptofano metabolizmo poveikį LA grupėje, mes taip pat įvertinome triptofano kiekį serume HC, BN ir LA grupėse, naudodami QQQ.Mes nustatėme, kad serumo triptofano kiekis LA sumažėjo, palyginti su HC arba BN (p < 0,001, 5d pav.), o tai atitinka ankstesnius duomenis, kad cirkuliuojančio triptofano kiekis pacientų, sergančių plaučių vėžiu, yra mažesnis nei sveikų kontrolinės grupės asmenų33, 34. ,35.Kitame tyrime, naudojant PET/CT žymeklį 11C-metil-L-triptofaną, nustatyta, kad triptofano signalo sulaikymo laikas plaučių vėžio audinyje buvo žymiai ilgesnis, palyginti su gerybiniais pažeidimais arba normaliais audiniais36.Manome, kad triptofano sumažėjimas LA serume gali atspindėti aktyvų triptofano įsisavinimą plaučių vėžio ląstelėse.
Taip pat žinoma, kad galutinis triptofano katabolizmo kinurenino kelio produktas yra NAD+37,38, kuris yra svarbus substratas gliceraldehido-3-fosfato reakcijai su 1,3-bisfosfogliceratu glikolizės metu39.Nors ankstesniuose tyrimuose pagrindinis dėmesys buvo skiriamas triptofano katabolizmo vaidmeniui imuninės sistemos reguliavime, mes siekėme išsiaiškinti sąveiką tarp triptofano disreguliacijos ir glikolitinių kelių, pastebėtų šiame tyrime.Yra žinoma, kad 7 tirpių pernešėjų šeima 5 (SLC7A5) yra triptofano transporteris43,44,45.Chinolino rūgšties fosforiboziltransferazė (QPRT) yra fermentas, esantis pasroviui nuo kinurenino kelio, kuris paverčia chinolino rūgštį į NAMN46.Patikrinus LUAD TCGA duomenų rinkinį, nustatyta, kad tiek SLC7A5, tiek QPRT auglio audinyje buvo žymiai padidintas, palyginti su normaliu audiniu (5e pav.).Šis padidėjimas buvo pastebėtas I ir II, taip pat III ir IV plaučių adenokarcinomos stadijose (papildomas 11 paveikslas), o tai rodo ankstyvus triptofano metabolizmo sutrikimus, susijusius su naviko atsiradimu.
Be to, LUAD-TCGA duomenų rinkinys parodė teigiamą koreliaciją tarp SLC7A5 ir GAPDH mRNR ekspresijos vėžiu sergančių pacientų mėginiuose (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5f pav.).Priešingai, reikšmingos koreliacijos tarp tokių genų parašų normaliame plaučių audinyje nenustatyta (r = 0,25, p = 0,06, 5f pav.).SLC7A5 (papildomas 12 paveikslas) numušimas A549 ląstelėse žymiai sumažino ląstelių triptofano ir NAD(H) lygį (5g, h pav.), todėl susilpnėjo glikolitinis aktyvumas, matuojamas ekstraląstelinio rūgštėjimo greičiu (ECAR) (1 pav.).5i).Taigi, remiantis metaboliniais serumo pokyčiais ir in vitro aptikimu, darome hipotezę, kad triptofano metabolizmas gali gaminti NAD + per kinurenino kelią ir atlikti svarbų vaidmenį skatinant glikolizę sergant plaučių vėžiu.
Tyrimai parodė, kad dėl klaidingai teigiamos piktybinių navikų diagnozės gali prireikti papildomų tyrimų, pvz., PET-CT, plaučių biopsijos ir pernelyg didelio LDCT aptiktų neapibrėžtų plaučių mazgų.31 Kaip parodyta 6 paveiksle, mūsų tyrimas nustatė serumo metabolitų grupę, turinčią potencialią diagnostinę vertę, kuri gali pagerinti rizikos stratifikaciją ir vėlesnį KT aptiktų plaučių mazgų valdymą.
Plaučių mazgai vertinami naudojant mažos dozės kompiuterinę tomografiją (LDCT) su vaizdiniais požymiais, rodančiais gerybines ar piktybines priežastis.Neaiški mazgų baigtis gali lemti dažnus tolesnius apsilankymus, nereikalingas intervencijas ir pernelyg didelį gydymą.Serumo metabolizmo klasifikatorių, turinčių diagnostinę vertę, įtraukimas gali pagerinti rizikos įvertinimą ir vėlesnį plaučių mazgų valdymą.PET pozitronų emisijos tomografija.
JAV NLST tyrimo ir Europos NELSON tyrimo duomenys rodo, kad didelės rizikos grupių atranka mažos dozės kompiuterine tomografija (LDCT) gali sumažinti mirtingumą nuo plaučių vėžio1,3.Tačiau LDCT aptiktų daugybės atsitiktinių plaučių mazgų rizikos įvertinimas ir vėlesnis klinikinis valdymas išlieka didžiausiu iššūkiu.Pagrindinis tikslas yra optimizuoti teisingą esamų LDCT pagrįstų protokolų klasifikaciją įtraukiant patikimus biomarkerius.
Kai kurie molekuliniai biomarkeriai, tokie kaip kraujo metabolitai, buvo nustatyti lyginant plaučių vėžį su sveikomis kontrolėmis15, 17.Šiame tyrime daugiausia dėmesio skyrėme serumo metabolomikos analizės taikymui, kad būtų galima atskirti gerybinius ir piktybinius plaučių mazgus, atsitiktinai aptiktus LDCT.Mes palyginome sveikos kontrolės (HC), gerybinių plaučių mazgų (BN) ir I stadijos plaučių adenokarcinomos (LA) mėginių pasaulinį metabolomą serume, naudodami UPLC-HRMS analizę.Mes nustatėme, kad HC ir BN turėjo panašius metabolinius profilius, o LA parodė reikšmingus pokyčius, palyginti su HC ir BN.Mes nustatėme du serumo metabolitų rinkinius, kurie skiria LA nuo HC ir BN.
Dabartinė LDCT pagrįsta gerybinių ir piktybinių mazgų identifikavimo schema daugiausia grindžiama mazgų dydžiu, tankiu, morfologija ir augimo greičiu laikui bėgant30.Ankstesni tyrimai parodė, kad mazgų dydis yra glaudžiai susijęs su plaučių vėžio tikimybe.Net ir didelės rizikos pacientams piktybinių navikų rizika mazguose <6 mm yra <1%.6–20 mm dydžio mazgelių piktybinių navikų rizika svyruoja nuo 8% iki 64%30.Todėl Fleischnerio draugija rekomenduoja 6 mm skersmenį įprastiniam KT stebėjimui.29 Tačiau didesnių nei 6 mm neapibrėžtų plaučių mazgų (IPN) rizikos įvertinimas ir valdymas nebuvo tinkamai atliktas31.Dabartinis įgimtos širdies ligos gydymas paprastai yra pagrįstas budriu laukimu ir dažnu KT stebėjimu.
Remdamiesi patvirtintu metabolomu, pirmą kartą parodėme, kad sveikų asmenų ir gerybinių mazgų, kurių dydis yra <6 mm, metabolominių parašų sutapimas.Biologinis panašumas atitinka ankstesnius KT duomenis, kad piktybinių navikų rizika, kai mazgeliai <6 mm, yra tokia pat maža, kaip ir tiriamiesiems be mazgų.30 Reikėtų pažymėti, kad mūsų rezultatai taip pat rodo, kad gerybiniai mazgeliai <6 mm ir ≥6 mm metabolominių profilių panašumas, o tai rodo, kad funkcinis gerybinės etiologijos apibrėžimas yra nuoseklus, nepaisant mazgo dydžio.Taigi, šiuolaikinės diagnostinės serumo metabolitų grupės gali atlikti vieną tyrimą kaip atmetimo testą, kai iš pradžių KT aptinkami mazgeliai, ir gali sumažinti serijinį stebėjimą.Tuo pačiu metu ta pati metabolinių biomarkerių grupė išskyrė ≥6 mm dydžio piktybinius mazgus nuo gerybinių mazgų ir pateikė tikslias panašaus dydžio IPN ir dviprasmiškų morfologinių požymių prognozes KT vaizduose.Šis serumo metabolizmo klasifikatorius gerai numatė ≥6 mm mazgų, kurių AUC buvo 0,927, piktybinius navikus.Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad unikalūs serumo metabolominiai parašai gali konkrečiai atspindėti ankstyvus naviko sukeltus metabolinius pokyčius ir turėti potencialią rizikos prognozę, nepriklausomai nuo mazgo dydžio.
Pažymėtina, kad plaučių adenokarcinoma (LUAD) ir plokščiųjų ląstelių karcinoma (LUSC) yra pagrindiniai nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (NSCLC) tipai.Atsižvelgiant į tai, kad LUSC yra stipriai susijęs su tabako vartojimu47, o LUAD yra dažniausia atsitiktinių plaučių mazgų, aptiktų atliekant KT atranką48, histologija, mūsų klasifikatoriaus modelis buvo specialiai sukurtas I stadijos adenokarcinomos mėginiams.Wangas ir kolegos taip pat sutelkė dėmesį į LUAD ir nustatė devynis lipidų parašus, naudodami lipidomiką, kad atskirtų ankstyvos stadijos plaučių vėžį nuo sveikų asmenų17.Mes išbandėme dabartinį klasifikatoriaus modelį su 16 I stadijos LUSC ir 74 gerybinių mazgų atvejų ir stebėjome mažą LUSC prognozavimo tikslumą (AUC 0, 776), o tai rodo, kad LUAD ir LUSC gali turėti savo metabolominius parašus.Iš tiesų buvo įrodyta, kad LUAD ir LUSC skiriasi etiologija, biologine kilme ir genetinėmis aberacijomis49.Todėl kiti histologijos tipai turėtų būti įtraukti į mokymo modelius, skirtus plaučių vėžio aptikimui pagal populiaciją atrankos programose.
Čia mes nustatėme šešis dažniausiai pakeistus plaučių adenokarcinomos būdus, palyginti su sveikomis kontrolėmis ir gerybiniais mazgeliais.Ksantinas ir hipoksantinas yra įprasti purino metabolizmo metabolitai.Remiantis mūsų rezultatais, tarpinių produktų, susijusių su purino metabolizmu, pacientų, sergančių plaučių adenokarcinoma, serume arba audiniuose žymiai padidėjo, palyginti su sveikais kontroliniais pacientais arba pacientais ikiinvazinėje stadijoje15, 50.Padidėjęs ksantino ir hipoksantino kiekis serume gali atspindėti anabolizmą, reikalingą sparčiai daugėjančioms vėžio ląstelėms.Gliukozės metabolizmo sutrikimas yra gerai žinomas vėžio metabolizmo požymis51.Čia mes pastebėjome reikšmingą piruvato ir laktato padidėjimą LA grupėje, palyginti su HC ir BN grupe, o tai atitinka ankstesnius pranešimus apie glikolitinio kelio anomalijas nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu (NSCLC) sergančių pacientų serumo metabolomuose. sveikos kontrolės.rezultatai yra nuoseklūs52,53.
Svarbu tai, kad plaučių adenokarcinomų serume pastebėjome atvirkštinę koreliaciją tarp piruvato ir triptofano metabolizmo.Serumo triptofano kiekis LA grupėje buvo sumažintas, palyginti su HC arba BN grupe.Įdomu tai, kad ankstesniame didelio masto tyrime, kuriame dalyvavo būsimoji grupė, nustatyta, kad mažas cirkuliuojančio triptofano kiekis buvo susijęs su padidėjusia plaučių vėžio rizika54.Triptofanas yra nepakeičiama aminorūgštis, kurią gauname tik su maistu.Darome išvadą, kad triptofano sumažėjimas serume sergant plaučių adenokarcinoma gali atspindėti greitą šio metabolito išeikvojimą.Gerai žinoma, kad galutinis triptofano katabolizmo produktas per kinurenino kelią yra de novo NAD+ sintezės šaltinis.Kadangi NAD+ daugiausia gaminamas gelbėjimo būdu, NAD+ svarba triptofano metabolizmui sveikatai ir ligoms dar turi būti nustatyta46.Mūsų atlikta TCGA duomenų bazės analizė parodė, kad triptofano pernešėjo tirpių medžiagų transporterio 7A5 (SLC7A5) ekspresija reikšmingai padidėjo sergant plaučių adenokarcinoma, palyginti su normalia kontrole, ir teigiamai koreliavo su glikolitinio fermento GAPDH ekspresija.Ankstesni tyrimai daugiausia buvo skirti triptofano katabolizmo vaidmeniui slopinant priešnavikinį imuninį atsaką 40, 41, 42.Čia parodome, kad triptofano įsisavinimo slopinimas, numušus SLC7A5 plaučių vėžio ląstelėse, vėliau sumažina ląstelių NAD lygį ir kartu susilpnina glikolitinį aktyvumą.Apibendrinant, mūsų tyrimas suteikia biologinį pagrindą serumo metabolizmo pokyčiams, susijusiems su piktybine plaučių adenokarcinomos transformacija.
EGFR mutacijos yra dažniausios NSŠLC sergančių pacientų mutacijos.Savo tyrime nustatėme, kad pacientų, turinčių EGFR mutaciją (n = 41), bendras metabolinis profilis buvo panašus į pacientų, sergančių laukinio tipo EGFR (n = 31), nors kai kurių EGFR mutantų pacientų, sergančių acilkarnitinu, serume sumažėjo koncentracija.Nustatyta acilkarnitinų funkcija yra pernešti acilo grupes iš citoplazmos į mitochondrijų matricą, o tai lemia riebalų rūgščių oksidaciją, gaminant energiją55.Remiantis mūsų išvadomis, neseniai atliktas tyrimas taip pat nustatė panašius metabolomų profilius tarp EGFR mutantų ir EGFR laukinio tipo navikų, analizuodamas 102 plaučių adenokarcinomos audinių mėginių visuotinį metabolomą50.Įdomu tai, kad acilkarnitino kiekis taip pat buvo rastas EGFR mutantų grupėje.Todėl, ar acilkarnitino lygio pokyčiai atspindi EGFR sukeltus metabolinius pokyčius ir pagrindinius molekulinius kelius, gali reikėti toliau tirti.
Apibendrinant, mūsų tyrimas nustato serumo metabolinį klasifikatorių, skirtą diferencinei plaučių mazgų diagnozei, ir siūlo darbo eigą, kuri gali optimizuoti rizikos vertinimą ir palengvinti klinikinį valdymą, pagrįstą KT skenavimo patikra.
Šį tyrimą patvirtino Sun Yat-sen universiteto vėžio ligoninės etikos komitetas, pirmoji Sun Yat-sen universiteto susijusi ligoninė ir Džengdžou universiteto vėžio ligoninės etikos komitetas.Atradimo ir vidinio patvirtinimo grupėse buvo paimti 174 serumai iš sveikų asmenų ir 244 serumai iš gerybinių mazgų iš asmenų, kuriems kasmet atliekami medicininiai patikrinimai Vėžio kontrolės ir prevencijos departamente, Sun Yat-sen universiteto vėžio centre, ir 166 gerybiniai mazgeliai.serumas.I stadijos plaučių adenokarcinomos buvo paimtos iš Sun Yat-sen universiteto vėžio centro.Išorinio patvirtinimo grupėje buvo 48 gerybinių mazgų atvejai, 39 I stadijos plaučių adenokarcinomos atvejai iš Sun Yat-sen universiteto pirmosios dukterinės ligoninės ir 24 I stadijos plaučių adenokarcinomos atvejai iš Džengdžou vėžio ligoninės.Sun Yat-sen universiteto vėžio centras taip pat surinko 16 I stadijos plokščialąstelinio plaučių vėžio atvejų, kad patikrintų nustatyto metabolinio klasifikatoriaus diagnostinį gebėjimą (paciento charakteristikos pateiktos 5 papildomoje lentelėje).Atradimų grupės ir vidinės patvirtinimo grupės pavyzdžiai buvo renkami nuo 2018 m. sausio mėn. iki 2020 m. gegužės mėn. Išorinio patvirtinimo kohortos pavyzdžiai buvo renkami nuo 2021 m. rugpjūčio mėn. iki 2022 m. spalio mėn. Siekiant sumažinti šališkumą dėl lyties, kiekvienam buvo priskirtas maždaug vienodas vyrų ir moterų atvejų skaičius. kohorta.Atradimų komanda ir vidinės peržiūros komanda.Dalyvio lytis buvo nustatyta remiantis savęs ataskaita.Iš visų dalyvių buvo gautas informuotas sutikimas ir kompensacija nebuvo suteikta.Tiriamieji su gerybiniais mazgeliais buvo tie, kurių KT skenavimo balas buvo stabilus 2–5 metus analizės metu, išskyrus 1 atvejį iš išorinio patvirtinimo mėginio, kuris buvo paimtas prieš operaciją ir diagnozuotas histopatologiniu būdu.Išskyrus lėtinį bronchitą.Plaučių adenokarcinomos atvejai buvo surinkti prieš plaučių rezekciją ir patvirtinti patologine diagnoze.Kraujo mėginiai nevalgius buvo paimti į serumo atskyrimo mėgintuvėlius be jokių antikoaguliantų.Kraujo mėginiai buvo krešėti 1 valandą kambario temperatūroje ir tada centrifuguoti 2851 × g 10 minučių 4 ° C temperatūroje, kad būtų surinktas serumo supernatantas.Serumo alikvotinės dalys buvo užšaldytos -80 ° C temperatūroje iki metabolito ekstrahavimo.Sun Yat-sen universiteto vėžio centro Vėžio prevencijos ir medicininės apžiūros skyrius surinko serumo telkinį iš 100 sveikų donorų, įskaitant vienodą skaičių vyrų ir moterų nuo 40 iki 55 metų amžiaus.Sumaišyti vienodi kiekvieno donoro mėginio tūriai, gautas telkinys padalytas į alikvotas ir laikomas -80 °C temperatūroje.Serumo mišinys buvo naudojamas kaip etaloninė medžiaga kokybės kontrolei ir duomenų standartizavimui.
Etaloninis serumas ir tiriamieji mėginiai buvo atšildyti, o metabolitai ekstrahuoti kombinuotu ekstrahavimo metodu (MTBE/metanolis/vanduo)56.Trumpai tariant, 50 μl serumo buvo sumaišyta su 225 μl ledo šalto metanolio ir 750 μl ledo šalto metilo tret-butilo eterio (MTBE).Išmaišykite mišinį ir inkubuokite ant ledo 1 valandą.Tada mėginiai buvo sumaišyti ir sumaišyti su sūkuriu su 188 μl MS klasės vandens, kuriame yra vidinių standartų (13C-laktatas, 13C3-piruvatas, 13C-metioninas ir 13C6-izoleucinas, įsigytas iš Cambridge Isotope Laboratories).Tada mišinys buvo centrifuguojamas 15 000 × g 10 minučių 4 ° C temperatūroje, o apatinė fazė buvo perkelta į du mėgintuvėlius (kiekvienas po 125 μL), kad būtų galima atlikti LC-MS analizę teigiamais ir neigiamais režimais.Galiausiai mėginys buvo išgarintas iki sauso didelio greičio vakuuminiame koncentratoriuje.
Išdžiovinti metabolitai buvo ištirpinti 120 μl 80% acetonitrilo, maišomi 5 minutes ir centrifuguojami 15 000 × g 10 minučių 4 ° C temperatūroje.Supernatantai buvo perkelti į gintaro spalvos stiklo buteliukus su mikroįdėklais metabolomikos tyrimams.Netikslinė metabolomikos analizė naudojant itin efektyvią skysčių chromatografijos ir didelės skiriamosios gebos masės spektrometrijos (UPLC-HRMS) platformą.Metabolitai buvo atskirti naudojant Dionex Ultimate 3000 UPLC sistemą ir ACQUITY BEH Amido kolonėlę (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Esant teigiamų jonų režimui, judriosios fazės buvo 95 % (A) ir 50 % acetonitrilo (B), kurių kiekvienoje buvo 10 mmol/l amonio acetato ir 0,1 % skruzdžių rūgšties.Esant neigiamam režimui, judriosiose A ir B fazėse buvo atitinkamai 95% ir 50% acetonitrilo, abiejose fazėse buvo 10 mmol/L amonio acetato, pH = 9. Gradiento programa buvo tokia: 0–0,5 min., 2% B;0,5–12 min., 2–50 % B;12–14 min., 50–98 % B;14–16 min., 98 % B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1–20 min., 2% B. Kolonėlė buvo palaikoma 40 °C, o mėginys - 10 °C automatiniame mėginių ėmimo įrenginyje.Srauto greitis buvo 0,3 ml/min., įpurškimo tūris – 3 μl.Q-Exactive Orbitrap masės spektrometras (Thermo Fisher Scientific) su elektropurškimo jonizacijos (ESI) šaltiniu veikė viso skenavimo režimu ir buvo sujungtas su ddMS2 stebėjimo režimu, kad būtų galima surinkti didelius duomenų kiekius.MS parametrai buvo nustatyti taip: purškimo įtampa +3,8 kV/- 3,2 kV, kapiliarinė temperatūra 320°C, apsauginės dujos 40 arb, pagalbinės dujos 10 arb, zondo šildytuvo temperatūra 350°C, skenavimo diapazonas 70-1050 m/val. rezoliucija.70 000. Duomenys buvo gauti naudojant Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Duomenų kokybei įvertinti buvo sukurti jungtiniai kokybės kontrolės (QC) mėginiai, iš kiekvieno mėginio pašalinus 10 μL supernatanto alikvotas.Analitinės sekos pradžioje buvo analizuojamos šešios kokybės kontrolės mėginių injekcijos, siekiant įvertinti UPLC-MS sistemos stabilumą.Tada į partiją periodiškai įvedami kokybės kontrolės mėginiai.Visos 11 šio tyrimo serumo mėginių partijų buvo analizuojamos LC-MS.100 sveikų donorų serumo mišinio alikvotinės dalys buvo naudojamos kaip etaloninė medžiaga atitinkamose partijose, kad būtų galima stebėti ekstrahavimo procesą ir koreguoti partijos poveikį.Sun Yat-sen universiteto Metabolomikos centre buvo atlikta netikslinga atradimų grupės, vidinės patvirtinimo grupės ir išorinio patvirtinimo grupės metabolomikos analizė.Išorinė Guangdongo technologijos universiteto analizės ir bandymų centro laboratorija taip pat ištyrė 40 mėginių iš išorinės kohortos, kad patikrintų klasifikatoriaus modelio veikimą.
Po ekstrahavimo ir atstatymo absoliutus serumo metabolitų kiekis buvo išmatuotas naudojant itin didelio efektyvumo skysčių chromatografijos-tandemo masės spektrometriją (Agilent 6495 trigubą kvadrupolį) su elektropurškimo jonizacijos (ESI) šaltiniu kelių reakcijų stebėjimo (MRM) režimu.Metabolitams atskirti buvo naudojama ACQUITY BEH Amido kolonėlė (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Mobiliąją fazę sudarė 90% (A) ir 5% acetonitrilas (B) su 10 mmol/l amonio acetatu ir 0,1% amoniako tirpalu.Gradiento programa buvo tokia: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min., 0–15% B;6,5–8 min., 15% B;8–8,5 min., 15%–0% B;8,5–11,5 min., 0%B.Kolonėlė buvo palaikoma 40 ° C temperatūroje, o mėginys - 10 ° C automatiniame mėginių ėmimo įrenginyje.Srauto greitis buvo 0,3 ml/min., o injekcijos tūris – 1 μL.MS parametrai buvo nustatyti taip: kapiliarinė įtampa ±3,5 kV, purkštuvo slėgis 35 psi, apvalkalo dujų srautas 12 L/min, apvalkalo dujų temperatūra 350°C, džiovinimo dujų temperatūra 250°C, džiovinimo dujų srautas 14 l/min.Triptofano, piruvato, laktato, hipoksantino ir ksantino MRM konversijos buvo 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 ir 151,0–107.9 atitinkamai.Duomenys buvo renkami naudojant Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Serumo mėginiams triptofanas, piruvatas, laktatas, hipoksantinas ir ksantinas buvo kiekybiškai įvertinti naudojant standartinių mišinių tirpalų kalibravimo kreives.Ląstelių mėginiuose triptofano kiekis buvo normalizuotas pagal vidinį standartą ir ląstelių baltymų masę.
Didžiausias ekstrahavimas (m/z ir sulaikymo laikas (RT)) buvo atliktas naudojant Compound Discovery 3.1 ir TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Siekiant pašalinti galimus skirtumus tarp partijų, kiekviena tiriamojo mėginio būdinga smailė buvo padalinta iš tos pačios partijos etaloninės medžiagos būdingos smailės, kad būtų gautas santykinis gausumas.Vidinių standartų santykiniai standartiniai nuokrypiai prieš standartizavimą ir po jo pateikti 6 papildomoje lentelėje. Dviejų grupių skirtumai buvo apibūdinti klaidingų atradimų dažniu (FDR<0,05, Wilcoxon signed rango testas) ir kartojimo pokyčiu (>1,2 arba <0,83).Neapdoroti išgautų savybių MS duomenys ir etaloniniai serumo koreguoti MS duomenys rodomi atitinkamai 1 papildomuose ir 2 papildomuose duomenyse.Didžiausia anotacija buvo atlikta remiantis keturiais apibrėžtais identifikavimo lygiais, įskaitant identifikuotus metabolitus, tariamai anotuotus junginius, tariamai apibūdintas junginių klases ir nežinomus junginius22.Remiantis duomenų bazės paieškomis „Combination Discovery 3.1“ (mzCloud, HMDB, Chemspider), biologiniai junginiai, kurių MS / MS atitiko patvirtintus standartus arba tikslios atitikties anotacijas mzCloud (balas > 85) arba Chemspider, galiausiai buvo atrinkti kaip tarpiniai tarpai tarp diferencinio metabolomo.Kiekvienos ypatybės didžiausios anotacijos yra įtrauktos į 3 papildomus duomenis. MetaboAnalyst 5.0 buvo naudojamas sumos normalizuotų metabolitų gausos vienamatei analizei.MetaboAnalyst 5.0 taip pat įvertino KEGG kelio praturtinimo analizę, pagrįstą žymiai skirtingais metabolitais.Pagrindinių komponentų analizė (PCA) ir dalinė mažiausiųjų kvadratų diskriminacinė analizė (PLS-DA) buvo analizuojama naudojant ropls programinės įrangos paketą (v.1.26.4) su dėklo normalizavimu ir automatiniu mastelio keitimu.Optimalus metabolito biomarkerio modelis mazgelių piktybiniams navikams prognozuoti buvo sukurtas naudojant dvejetainę logistinę regresiją su mažiausiu absoliučiu susitraukimu ir atrankos operatoriumi (LASSO, R paketas v.4.1-3).Diskriminacinio modelio veikimas aptikimo ir patvirtinimo rinkiniuose buvo apibūdintas įvertinus AUC pagal ROC analizę pagal pROC paketą (v.1.18.0.).Optimali tikimybės riba buvo gauta remiantis modelio maksimaliu Youden indeksu (jautrumas + specifiškumas – 1).Mėginiai, kurių vertės yra mažesnės arba didesnės už slenkstį, bus atitinkamai prognozuojami kaip gerybiniai mazgeliai ir plaučių adenokarcinoma.
A549 ląstelės (#CCL-185, American Type Culture Collection) buvo auginamos F-12K terpėje, kurioje yra 10% FBS.Į lentivirusinį vektorių pLKO.1-puro buvo įterptos trumpos plaukų segtuko RNR (shRNR) sekos, nukreiptos į SLC7A5, ir netaikingą kontrolę (NC).Antisensinės shSLC7A5 sekos yra šios: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Antikūnai prieš SLC7A5 (#5347) ir tubuliną (#2148) buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology.Western blot analizei buvo naudojami antikūnai prieš SLC7A5 ir tubuliną praskiedus 1:1000.
Seahorse XF glikolitinis streso testas matuoja tarpląstelinio rūgštėjimo (ECAR) lygį.Atliekant tyrimą, gliukozė, oligomicinas A ir 2-DG buvo skiriami nuosekliai, kad būtų galima patikrinti ląstelių glikolitinį pajėgumą, išmatuotą ECAR.
A549 ląstelės, transfekuotos netiksline kontrole (NC) ir shSLC7A5 (Sh1, Sh2), buvo dedamos per naktį į 10 cm skersmens indus.Ląstelių metabolitai buvo ekstrahuoti 1 ml ledo šalto 80% vandeninio metanolio.Metanolio tirpale esančios ląstelės buvo nubrauktos, surenkamos į naują mėgintuvėlį ir centrifuguojamos 15 000 × g 15 minučių 4 ° C temperatūroje.Surinkite 800 µl supernatanto ir išdžiovinkite naudojant didelio greičio vakuuminį koncentratorių.Tada išdžiovintos metabolito granulės buvo analizuojamos triptofano kiekiui nustatyti, naudojant LC-MS / MS, kaip aprašyta aukščiau.Ląstelių NAD(H) lygiai A549 ląstelėse (NC ir shSLC7A5) buvo išmatuoti naudojant kiekybinį NAD+/NADH kolorimetrinį rinkinį (#K337, BioVision) pagal gamintojo instrukcijas.Siekiant normalizuoti metabolitų kiekį, kiekvienam mėginiui buvo matuojamas baltymų kiekis.
Jokie statistiniai metodai nebuvo naudojami preliminariai imties dydžiui nustatyti.Ankstesni metabolomikos tyrimai, skirti biomarkerių atradimui 15, 18, buvo laikomi dydžio nustatymo etalonais, ir, palyginti su šiomis ataskaitomis, mūsų pavyzdys buvo tinkamas.Nė vienas mėginys nebuvo pašalintas iš tyrimo grupės.Serumo mėginiai buvo atsitiktine tvarka priskirti atradimų grupei (306 atvejai, 74,6 %) ir vidinei patvirtinimo grupei (104 atvejai, 25, 4 %) netiksliniams metabolomikos tyrimams.Taip pat atsitiktinai atrinkome 70 atvejų iš kiekvienos grupės iš tikslinių metabolomikos tyrimų atradimų rinkinio.Rinkdami ir analizuodami LC-MS duomenis, tyrėjai buvo apakinti nuo grupių priskyrimo.Statistinė metabolomikos duomenų analizė ir ląstelių eksperimentai aprašyti atitinkamuose skyriuose Rezultatai, paveikslų legendos ir metodai.Ląstelių triptofano, NADT ir glikolitinio aktyvumo kiekybinis įvertinimas buvo atliktas tris kartus nepriklausomai su identiškais rezultatais.
Norėdami gauti daugiau informacijos apie tyrimo planą, žr. su šiuo straipsniu susietą Natural Portfolio ataskaitos santrauką.
Neapdoroti išgautų savybių MS duomenys ir normalizuoti etaloninio serumo MS duomenys rodomi atitinkamai 1 papildomuose ir 2 papildomuose duomenyse.Diferencinių savybių didžiausios anotacijos pateiktos 3 papildomuose duomenyse. LUAD TCGA duomenų rinkinį galima atsisiųsti iš https://portal.gdc.cancer.gov/.Įvesties duomenys diagramai braižyti pateikiami pirminiuose duomenyse.Šiam straipsniui pateikti šaltiniai.
Nacionalinė plaučių atrankos tyrimo grupė ir kt. Mirtingumo nuo plaučių vėžio mažinimas naudojant mažų dozių kompiuterinę tomografiją.Šiaurės Anglija.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ir Prophet, PC Plaučių vėžio patikra naudojant mažos dozės spiralinę KT: Nacionalinio plaučių atrankos tyrimo (NLST) rezultatai.J. Med.18 ekranas, 109–111 (2011).
De Koning, HJ ir kt.Mirtingumo nuo plaučių vėžio mažinimas atliekant tūrinę KT patikrą atsitiktinių imčių tyrime.Šiaurės Anglija.J. Med.382, 503–513 (2020).
Paskelbimo laikas: 2023-09-18