Kompiuterinės tomografijos (KT) būdu nustatytų plaučių mazgelių diferencinė diagnostika klinikinėje praktikoje išlieka iššūkiu. Šiame tyrime apibūdiname 480 serumo mėginių, įskaitant sveikų kontrolinių asmenų, gerybinių plaučių mazgelių ir I stadijos plaučių adenokarcinomos, bendrą metabolomą. Adenokarcinomos pasižymi unikaliais metabolominiais profiliais, o gerybinių mazgelių ir sveikų asmenų metabolominiai profiliai yra labai panašūs. Atradimų grupėje (n = 306) buvo nustatytas 27 metabolitų rinkinys, leidžiantis atskirti gerybinius ir piktybinius mazgelius. Diskriminacinio modelio AUC vidinės patvirtinimo (n = 104) ir išorinės patvirtinimo (n = 111) grupėse buvo atitinkamai 0,915 ir 0,945. Kelių analizė parodė padidėjusį glikolizės metabolitų kiekį, susijusį su sumažėjusiu triptofano kiekiu plaučių adenokarcinomos serume, palyginti su gerybiniais mazgeliais ir sveikomis kontrolinėmis grupėmis, ir leido manyti, kad triptofano įsisavinimas skatina glikolizę plaučių vėžio ląstelėse. Mūsų tyrimas pabrėžia serumo metabolitų biožymenų vertę vertinant KT būdu nustatytų plaučių mazgelių riziką.
Ankstyva diagnozė yra labai svarbi siekiant pagerinti vėžiu sergančių pacientų išgyvenamumą. JAV nacionalinio plaučių vėžio atrankinės patikros tyrimo (NLST) ir Europos NELSON tyrimo rezultatai parodė, kad mažos dozės kompiuterinė tomografija (LDKT) gali žymiai sumažinti mirtingumą nuo plaučių vėžio didelės rizikos grupėse1,2,3. Nuo tada, kai LDKT pradėta plačiai naudoti plaučių vėžio atrankai, besimptomių plaučių mazgelių radiologinių radinių dažnis toliau didėjo4. Plaučių mazgeliai apibrėžiami kaip židininiai neskaidrumai iki 3 cm skersmens5. Susiduriame su sunkumais vertinant piktybinio naviko tikimybę ir tvarkantis su dideliu skaičiumi plaučių mazgelių, atsitiktinai aptiktų LDKT metu. KT apribojimai gali lemti dažnus tolesnius tyrimus ir klaidingai teigiamus rezultatus, o tai lemia nereikalingą intervenciją ir perteklinį gydymą6. Todėl reikia sukurti patikimus ir naudingus biožymenis, kad būtų galima teisingai nustatyti plaučių vėžį ankstyvosiose stadijose ir diferencijuoti daugumą gerybinių mazgelių pradinio nustatymo metu7.
Išsami kraujo (serumo, plazmos, periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių) molekulinė analizė, įskaitant genomiką, proteomiką ar DNR metilinimą8,9,10, paskatino vis didesnį susidomėjimą diagnostinių plaučių vėžio biožymenų atradimu. Tuo tarpu metabolomikos metodai matuoja ląstelių galutinius produktus, kuriems įtakos turi endogeniniai ir egzogeniniai veiksmai, todėl yra taikomi ligos pradžiai ir baigčiai prognozuoti. Skysčių chromatografijos ir tandeminės masių spektrometrijos (LC-MS) metodas yra plačiai naudojamas metabolomikos tyrimams dėl didelio jautrumo ir plataus dinaminio diapazono, kuris gali apimti metabolitus, turinčius skirtingas fizikines ir chemines savybes11,12,13. Nors globali plazmos/serumo metabolominė analizė buvo naudojama siekiant nustatyti su plaučių vėžio diagnoze14,15,16,17 ir gydymo veiksmingumu susijusius biožymenis,18 serumo metabolitų klasifikatoriai, skirti atskirti gerybinius ir piktybinius plaučių mazgelius, vis dar turi būti daug ištirti. – dideli tyrimai.
Adenokarcinoma ir plokštųjų ląstelių karcinoma yra du pagrindiniai nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (NSCLC) potipiai. Įvairūs KT atrankos tyrimai rodo, kad adenokarcinoma yra dažniausias histologinis plaučių vėžio tipas1,19,20,21. Šiame tyrime panaudojome itin efektyviosios skysčių chromatografijos ir didelės skiriamosios gebos masių spektrometrijos (UPLC-HRMS) metodą, kad atliktume metabolomikos analizę iš viso 695 serumo mėginių, įskaitant sveikų kontrolinių asmenų, gerybinių plaučių mazgelių ir KT aptiktų ≤3 cm dydžio. I stadijos plaučių adenokarcinomos atranka. Nustatėme serumo metabolitų grupę, kuri skiria plaučių adenokarcinomą nuo gerybinių mazgelių ir sveikų kontrolinių asmenų. Kelių praturtinimo analizė parodė, kad nenormalus triptofano ir gliukozės metabolizmas yra dažni pokyčiai plaučių adenokarcinomoje, palyginti su gerybiniais mazgeliais ir sveikomis kontrolinėmis grupėmis. Galiausiai sukūrėme ir patvirtinome didelio specifiškumo ir jautrumo serumo metabolinį klasifikatorių, skirtą atskirti piktybinius ir gerybinius plaučių mazgelius, aptiktus LDKT, o tai gali padėti ankstyvoje diferencinėje diagnostikoje ir rizikos vertinime.
Šiame tyrime retrospektyviai buvo surinkti pagal lytį ir amžių suderinti serumo mėginiai iš 174 sveikų kontrolinių asmenų, 292 pacientų, sergančių gerybiniais plaučių mazgeliais, ir 229 pacientų, sergančių I stadijos plaučių adenokarcinoma. 695 tiriamųjų demografinės charakteristikos pateiktos 1 papildomoje lentelėje.
Kaip parodyta 1a paveiksle, Sun Yat-seno universiteto vėžio centre buvo surinkta iš viso 480 serumo mėginių, įskaitant 174 sveikų kontrolinių asmenų (HC), 170 gerybinių mazgelių (BN) ir 136 I stadijos plaučių adenokarcinomos (LA) mėginius. Atradimų kohorta netiksliniam metabolominiam profiliavimui naudojant ultraefektyviosios skysčių chromatografijos ir didelės skiriamosios gebos masių spektrometrijos (UPLC-HRMS) metodą. Kaip parodyta 1 papildomame paveiksle, siekiant sukurti klasifikavimo modelį ir toliau tirti diferencialinių kelių analizę, buvo nustatyti skirtingi metabolitai tarp LA ir HC, LA ir BN. 104 mėginiai, surinkti Sun Yat-seno universiteto vėžio centro, ir 111 mėginių, surinktų dviejų kitų ligoninių, buvo atitinkamai vidiniai ir išoriniai patvirtinti.
a Tiriamoji populiacija atradimo kohortoje, kuriai atlikta globali serumo metabolomikos analizė naudojant ultraefektyviosios skysčių chromatografijos ir didelės skiriamosios gebos masių spektrometrijos metodą (UPLC-HRMS). b Dalinė mažiausių kvadratų diskriminantinė analizė (PLS-DA), atlikta su 480 serumo mėginių iš tyrimo kohortos, įskaitant sveikus kontrolinius asmenis (HC, n = 174), gerybinius mazgelius (BN, n = 170) ir I stadijos plaučių adenokarcinomą (Los Andželas, n = 136), bendru metabolitu. +ESI, teigiamas elektros purškimo jonizacijos režimas, -ESI, neigiamas elektros purškimo jonizacijos režimas. c–e Metabolitai, kurių gausa dviejose duotose grupėse reikšmingai skiriasi (dvipusis Wilcoxon ženklų rango testas, klaidingo atradimo dažnio pakoreguota p vertė, FDR <0,05), parodyti raudonai (pokytis kartus > 1,2) ir mėlynai (pokytis kartus < 0,83). ), parodyti ugnikalnio grafike. f Hierarchinis klasterizavimo šilumos žemėlapis, rodantis reikšmingus anotuotų metabolitų skaičiaus skirtumus tarp LA ir BN. Šaltinio duomenys pateikiami šaltinio duomenų failų pavidalu.
Bendras serumo metabolitas – 174 HC, 170 BN ir 136 LA – atradimo grupėje buvo analizuojamas naudojant UPLC-HRMS analizę. Pirmiausia parodome, kad kokybės kontrolės (KK) mėginiai glaudžiai susitelkia neprižiūrimos pagrindinių komponenčių analizės (PCA) modelio centre, patvirtindami dabartinio tyrimo rezultatų stabilumą (2 papildomas paveikslas).
Kaip parodyta 1b paveiksle atliktoje dalinėje mažiausių kvadratų diskriminantų analizėje (PLS-DA), nustatėme aiškius skirtumus tarp LA ir BN, LA ir HC teigiamoje (+ESI) ir neigiamoje (-ESI) elektrospray jonizacijos režimuose. Tačiau reikšmingų skirtumų tarp BN ir HC +ESI ir -ESI sąlygomis nerasta.
Radome 382 skirtingus požymius tarp LA ir HC, 231 skirtingus požymius tarp LA ir BN ir 95 skirtingus požymius tarp BN ir HC (Wilcoxon ženklų rango testas, FDR <0,05 ir daugkartinis pokytis >1,2 arba <0,83) (1c–e pav.). Piko reikšmės buvo papildomai anotuotos (3 papildomi duomenys) duomenų bazėje („mzCloud“ / HMDB / „Chemspider“ biblioteka) pagal m/z vertę, sulaikymo laiką ir fragmentacijos masių spektro paiešką (išsamesnė informacija aprašyta skyriuje „Metodai“)22. Galiausiai buvo nustatyti 33 ir 38 anotuoti metabolitai, kurių gausumas reikšmingai skyrėsi, atitinkamai LA ir BN (1f pav. ir 2 papildoma lentelė) ir LA ir HC (3 papildomas pav. ir 2 papildoma lentelė). Priešingai, BN ir HC buvo nustatyti tik 3 metabolitai, kurių gausumas reikšmingai skyrėsi (2 papildoma lentelė), o tai atitinka BN ir HC persidengimą PLS-DA. Šie skirtingi metabolitai apima platų biocheminių medžiagų spektrą (4 papildomas pav.). Apibendrinus šiuos rezultatus, galima teigti, kad serumo metabolomo pokyčiai atspindi piktybinę ankstyvos stadijos plaučių vėžio transformaciją, palyginti su gerybiniais plaučių mazgeliais ar sveikais asmenimis. Tuo tarpu BN ir HC serumo metabolomo panašumas rodo, kad gerybiniai plaučių mazgeliai gali turėti daug bendrų biologinių savybių su sveikais asmenimis. Atsižvelgiant į tai, kad epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR) geno mutacijos yra dažnos sergant 23 potipio plaučių adenokarcinoma, siekėme nustatyti vairuotojo mutacijų įtaką serumo metabolomui. Tada išanalizavome bendrą 72 atvejų, kuriems nustatytas EGFR statusas, metabolominį profilį plaučių adenokarcinomos grupėje. Įdomu tai, kad PCA analizėje radome panašius profilius tarp pacientų, kuriems nustatytas EGFR mutantas (n = 41), ir pacientų, kuriems nustatytas EGFR laukinio tipo mutacija (n = 31), (papildomas 5a pav.). Tačiau nustatėme 7 metabolitus, kurių gausa reikšmingai pakito pacientams, kuriems nustatytas EGFR mutacija, palyginti su pacientais, kuriems nustatytas laukinio tipo EGFR (t testas, p < 0,05 ir kartų pokytis > 1,2 arba < 0,83) (papildomas 5b pav.). Dauguma šių metabolitų (5 iš 7) yra acilkarnitinai, kurie atlieka svarbų vaidmenį riebalų rūgščių oksidacijos procesuose.
Kaip parodyta 2a paveiksle parodytoje darbo eigoje, mazgelinių klasifikavimo biožymenys buvo gauti naudojant mažiausio absoliutaus susitraukimo operatorius ir atranką, pagrįstą 33 skirtingais metabolitais, identifikuotais LA (n = 136) ir BN (n = 170). Geriausias kintamųjų derinys (LASSO) – dvejetainis logistinės regresijos modelis. Modelio patikimumui patikrinti buvo naudojamas dešimteriopas kryžminis patvirtinimas. Kintamųjų atranka ir parametrų reguliavimas koreguojami pagal tikimybės maksimizavimo baudą su parametru λ24. Visuotinė metabolomikos analizė buvo atlikta atskirai vidinės patvirtinimo (n = 104) ir išorinės patvirtinimo (n = 111) grupėse, siekiant patikrinti diskriminantinio modelio klasifikavimo efektyvumą. Todėl 27 metabolitai atradimų rinkinyje buvo identifikuoti kaip geriausias diskriminantinis modelis su didžiausia vidutine AUC verte (2b pav.), iš kurių 9 turėjo padidėjusį aktyvumą, o 18 – sumažėjusį aktyvumą LA, palyginti su BN (2c pav.).
Plaučių mazgelių klasifikatoriaus kūrimo darbo eiga, įskaitant geriausio serumo metabolitų skydelio parinkimą atradimo rinkinyje naudojant dvejetainį logistinės regresijos modelį, taikant dešimteriopą kryžminį patvirtinimą, ir prognozavimo efektyvumo vertinimą vidiniuose ir išoriniuose patvirtinimo rinkiniuose. b LASSO regresijos modelio kryžminio patvirtinimo statistika metaboliniams biožymenims atrinkti. Aukščiau pateikti skaičiai rodo vidutinį biožymenų, pasirinktų esant tam tikrai λ, skaičių. Raudona punktyrinė linija rodo vidutinę AUC vertę esant atitinkamai lambda. Pilkos paklaidų juostos rodo minimalią ir maksimalią AUC vertes. Taškinė linija rodo geriausią modelį su 27 pasirinktais biožymenimis. AUC, plotas po imtuvo veikimo charakteristikos (ROC) kreive. c 27 pasirinktų metabolitų pokyčiai LA grupėje, palyginti su BN grupe atradimo grupėje. Raudonas stulpelis – aktyvavimas. Mėlynas stulpelis rodo mažėjimą. d–f Imtuvo veikimo charakteristikos (ROC) kreivės, rodančios diskriminantinio modelio, pagrįsto 27 metabolitų deriniais atradimo, vidinio ir išorinio patvirtinimo rinkiniuose, galią. Šaltinio duomenys pateikiami šaltinių duomenų failų pavidalu.
Remiantis šių 27 metabolitų svertiniais regresijos koeficientais, buvo sukurtas prognozavimo modelis (3 papildoma lentelė). Remiantis šiais 27 metabolitais atlikta ROC analizė parodė 0,933 plotą po kreive (AUC), jautrumą atradimo grupei – 0,868, o specifiškumą – 0,859 (2d pav.). Tuo tarpu iš 38 anotuotų skirtingų metabolitų tarp LA ir HC, 16 metabolitų rinkinys pasiekė 0,902 AUC, jautrumą – 0,801, o specifiškumą – 0,856, atskirdamas LA nuo HC (papildomas 6a–c paveikslas). Taip pat buvo palygintos AUC vertės, pagrįstos skirtingomis skirtingų metabolitų kartų pokyčio ribomis. Nustatėme, kad klasifikavimo modelis geriausiai veikė atskiriant LA ir BN (HC), kai kartų pokyčio lygis buvo nustatytas ties 1,2, palyginti su 1,5 arba 2,0 (papildomas 7a, b paveikslas). Klasifikavimo modelis, pagrįstas 27 metabolitų grupėmis, buvo toliau patvirtintas vidinėse ir išorinėse kohortose. Vidinio patvirtinimo AUC buvo 0,915 (jautrumas 0,867, specifiškumas 0,811) ir išorinio patvirtinimo – 0,945 (jautrumas 0,810, specifiškumas 0,979) (2e, f pav.). Siekiant įvertinti tarplaboratorinį efektyvumą, 40 išorinės kohortos mėginių buvo analizuojami išorinėje laboratorijoje, kaip aprašyta skyriuje „Metodai“. Klasifikavimo tikslumas pasiekė 0,925 AUC (8 papildomas paveikslas). Kadangi plaučių plokščialąstelinė karcinoma (LUSC) yra antras pagal dažnumą nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (NSCLC) potipis po plaučių adenokarcinomos (LUAL), taip pat išbandėme patvirtintą galimą metabolinių profilių naudingumą. BN ir 16 LUSC atvejų. LUSC ir BN atskyrimo AUC buvo 0,776 (9 papildomas paveikslas), o tai rodo prastesnį gebėjimą, palyginti su LUAD ir BN atskyrimu.
Tyrimai parodė, kad mazgelių dydis KT vaizduose teigiamai koreliuoja su piktybinio naviko tikimybe ir išlieka pagrindiniu mazgelių gydymo veiksniu25,26,27. Didelės NELSON atrankinio tyrimo kohortos duomenų analizė parodė, kad piktybinio naviko rizika tiriamiesiems, kurių mazgai <5 mm, buvo netgi panaši į tiriamųjų, kurių mazgų nebuvo28. Todėl minimalus dydis, kuriam gydyti reikalingas reguliarus KT stebėjimas, yra 5 mm, kaip rekomenduoja Britų krūtinės ląstos draugija (BTS), ir 6 mm, kaip rekomenduoja Fleischner draugija29. Tačiau didesni nei 6 mm mazgeliai be akivaizdžių gerybinių požymių, vadinami neapibrėžtais plaučių mazgeliais (IPN), išlieka pagrindiniu iššūkiu vertinant ir gydant klinikinėje praktikoje30,31. Toliau tyrėme, ar mazgelio dydis turėjo įtakos metabolominiams parašams, naudodami sujungtus mėginius iš atradimo ir vidinio patvirtinimo kohortų. Sutelkdami dėmesį į 27 patvirtintus biožymenis, pirmiausia palyginome HC ir BN metabolomų, kurių dydis mažesnis nei 6 mm, PCA profilius. Nustatėme, kad dauguma HC ir BN duomenų taškų sutapo, o tai rodo, kad serumo metabolitų lygiai abiejose grupėse buvo panašūs (3a pav.). BN ir LA požymių žemėlapiai skirtinguose dydžių diapazonuose išliko išsaugoti (3b, c pav.), o 6–20 mm diapazone pastebėtas skirtumas tarp piktybinių ir gerybinių mazgelių (3d pav.). Šios kohortos AUC buvo 0,927, specifiškumas – 0,868, o jautrumas – 0,820 prognozuojant 6–20 mm dydžio mazgelių piktybiškumą (3e, f pav.). Mūsų rezultatai rodo, kad klasifikatorius gali užfiksuoti ankstyvos piktybinės transformacijos sukeltus metabolinius pokyčius, neatsižvelgiant į mazgelio dydį.
ad PCA profilių palyginimas tarp nurodytų grupių, remiantis 27 metabolitų metaboliniu klasifikatoriumi. CC ir BN < 6 mm. b BN < 6 mm, palyginti su BN 6–20 mm. KP 6–20 mm, palyginti su KP 20–30 mm. g BN 6–20 mm ir KP 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; KP 6–20 mm, n = 89; KP 20–30 mm, n = 77. e Imtuvo veikimo charakteristikos (ROC) kreivė, rodanti diskriminantinio modelio veikimą 6–20 mm mazgeliams. f Tikimybių vertės buvo apskaičiuotos remiantis logistinės regresijos modeliu 6–20 mm mazgeliams. Pilka punktyrinė linija žymi optimalią ribinę vertę (0,455). Aukščiau pateikti skaičiai rodo Los Andželui prognozuojamų atvejų procentinę dalį. Naudokite dvipusį Student'o t testą. PCA – pagrindinių komponentų analizė. AUC plotas po kreive. Pradiniai duomenys pateikiami pradinių duomenų failų pavidalu.
Siekiant iliustruoti siūlomo piktybiškumo prognozavimo modelio veikimą, buvo atrinkti keturi mėginiai (44–61 metų amžiaus) su panašiu plaučių mazgelių dydžiu (7–9 mm) (4a, b pav.). Pradinio patikrinimo metu 1 atvejis buvo pateiktas kaip kietas mazgelis su kalcifikacija – požymis, susijęs su gerybiškumu, o 2 atvejis – kaip neapibrėžtas, iš dalies kietas mazgelis be akivaizdžių gerybinių požymių. Trys tolesni KT tyrimų etapai parodė, kad šie atvejai išliko stabilūs per 4 metus ir todėl buvo laikomi gerybiniais mazgeliais (4a pav.). Palyginti su klinikiniu serijinių KT tyrimų įvertinimu, vienkartinė serumo metabolitų analizė naudojant dabartinį klasifikatoriaus modelį greitai ir teisingai nustatė šiuos gerybinius mazgelius, remiantis tikimybiniais apribojimais (1 lentelė). 4b paveiksle 3 atvejo atveju parodytas mazgelis su pleuros retrakcijos požymiais, kurie dažniausiai siejami su piktybiškumu32. 4 atvejis pateiktas kaip neapibrėžtas, iš dalies kietas mazgelis be gerybinės priežasties įrodymų. Visi šie atvejai pagal klasifikatoriaus modelį buvo prognozuojami kaip piktybiniai (1 lentelė). Plaučių adenokarcinomos įvertinimas buvo parodytas histopatologiniu tyrimu po plaučių rezekcijos operacijos (4b pav.). Išorinio patvirtinimo rinkinyje metabolinis klasifikatorius tiksliai numatė du neapibrėžtų plaučių mazgelių, didesnių nei 6 mm, atvejus (papildomas 10 pav.).
Dviejų gerybinių mazgelių atvejų plaučių ašinio lango KT vaizdai. 1 atveju, atlikus KT tyrimą po 4 metų, nustatytas stabilus, kietas, 7 mm skersmens mazgelis su kalcifikacija dešinėje apatinėje skiltyje. 2 atveju, atlikus KT tyrimą po 5 metų, dešinėje viršutinėje skiltyje nustatytas stabilus, iš dalies kietas, 7 mm skersmens mazgelis. b Dviejų I stadijos adenokarcinomos atvejų prieš plaučių rezekciją plaučių ašinio lango KT vaizdai ir atitinkami patologiniai tyrimai. 3 atveju, atliktas dešiniojoje viršutinėje skiltyje, nustatytas 8 mm skersmens mazgelis su pleuros retrakcija. 4 atveju, atliktas kairiojoje viršutinėje skiltyje, nustatytas iš dalies kietas, 9 mm dydžio matinio stiklo mazgelis. Rezekuoto plaučių audinio hematoksilino ir eozino (H&E) dažymas (mastelio juosta = 50 μm) rodo plaučių adenokarcinomos acinarinio augimo modelį. Rodyklės rodo KT vaizduose aptiktus mazgelius. H&E vaizdai yra reprezentatyvūs patologo ištirtų kelių (>3) mikroskopinių laukų vaizdai.
Apibendrinus, mūsų rezultatai rodo serumo metabolitų biožymenų potencialią vertę diferencinėje plaučių mazgelių diagnostikoje, o tai gali kelti iššūkių vertinant KT patikrą.
Remdamiesi patvirtinta diferencinių metabolitų grupe, siekėme nustatyti biologinius ryšius, susijusius su pagrindiniais metaboliniais pokyčiais. „MetaboAnalyst“ atlikta KEGG kelio praturtėjimo analizė nustatė 6 bendrus reikšmingai pakitusius kelius tarp dviejų pateiktų grupių (LA vs. HC ir LA vs. BN, pakoreguotas p ≤ 0,001, poveikis > 0,01). Šiems pokyčiams buvo būdingi piruvato metabolizmo, triptofano metabolizmo, niacino ir nikotinamido metabolizmo, glikolizės, TCA ciklo ir purino metabolizmo sutrikimai (5a pav.). Tada atlikome tikslinę metabolomiką, kad patikrintume pagrindinius pokyčius naudodami absoliutų kiekybinį nustatymą. Dažniausių metabolitų nustatymas dažniausiai pakitusiuose keliuose buvo atliktas trigubos kvadrupolio masių spektrometrijos (QQQ) metodu, naudojant autentiškus metabolitų standartus. Metabolomikos tyrimo tikslinės imties demografinės charakteristikos pateiktos 4 papildomoje lentelėje. Kiekybinė analizė, atitinkanti mūsų bendrus metabolomikos rezultatus, patvirtino, kad hipoksantino ir ksantino, piruvato ir laktato kiekis LA buvo padidėjęs, palyginti su BN ir HC (5b, c pav., p <0,05). Tačiau reikšmingų šių metabolitų skirtumų tarp BN ir HC nerasta.
KEGG kelio praturtėjimo analizė, skirta reikšmingai skirtingiems metabolitams LA grupėje, palyginti su BN ir HC grupėmis. Buvo naudojamas dvipusis Globaltestas, o p vertės buvo pakoreguotos naudojant Holm-Bonferroni metodą (pakoreguotas p ≤ 0,001 ir efekto dydis > 0,01). b–d Violin grafikai rodo hipoksantino, ksantino, laktato, piruvato ir triptofano kiekius serume HC, BN ir LA, nustatytus LC-MS/MS (n = 70 kiekvienoje grupėje). Baltos ir juodos punktyrinės linijos atitinkamai žymi medianą ir kvartilį. e Violin grafikas rodo normalizuotą Log2TPM (transkriptų milijone) SLC7A5 ir QPRT mRNR raišką plaučių adenokarcinomoje (n = 513), palyginti su normaliu plaučių audiniu (n = 59) LUAD-TCGA duomenų rinkinyje. Baltas langelis žymi interkvartilinį diapazoną, horizontali juoda linija centre žymi medianą, o vertikali juoda linija, besitęsianti nuo langelio, žymi 95 % pasikliautinį intervalą (PI). f Pearsono koreliacijos grafikas, rodantis SLC7A5 ir GAPDH raišką plaučių adenokarcinomoje (n = 513) ir normaliame plaučių audinyje (n = 59) TCGA duomenų rinkinyje. Pilka sritis žymi 95 % PI. r, Pearsono koreliacijos koeficientas. g Normalizuoti ląsteliniai triptofano kiekiai A549 ląstelėse, transfekuotose nespecifine shRNR kontrole (NC) ir shSLC7A5 (Sh1, Sh2), nustatyti LC-MS/MS metodu. Pateikta penkių biologiškai nepriklausomų mėginių kiekvienoje grupėje statistinė analizė. h NADt (bendro NAD, įskaitant NAD+ ir NADH) kiekiai A549 ląstelėse (NC) ir SLC7A5 slopinančiose A549 ląstelėse (Sh1, Sh2). Pateikta trijų biologiškai nepriklausomų mėginių kiekvienoje grupėje statistinė analizė. i A549 ląstelių glikolizinis aktyvumas prieš ir po SLC7A5 slopinimo buvo matuojamas ekstraląsteliniu rūgštėjimo greičiu (ECAR) (n = 4 biologiškai nepriklausomi mėginiai kiekvienoje grupėje). 2-DG,2-deoksi-D-gliukozė. (b–h) paveiksluose buvo naudojamas dvipusis Stjudento t testas. (g–i) paveiksluose paklaidų juostos žymi vidurkį ± SD, kiekvienas eksperimentas buvo atliktas tris kartus nepriklausomai ir rezultatai buvo panašūs. Šaltinio duomenys pateikiami šaltinių duomenų failų pavidalu.
Atsižvelgdami į reikšmingą pakitusio triptofano metabolizmo poveikį LA grupėje, taip pat įvertinome triptofano kiekį serume HC, BN ir LA grupėse, naudodami QQQ. Nustatėme, kad LA grupėje triptofano kiekis serume buvo sumažėjęs, palyginti su HC ar BN (p < 0,001, 5d pav.), o tai atitinka ankstesnius tyrimus, kad plaučių vėžiu sergantiems pacientams cirkuliuojantis triptofano kiekis yra mažesnis nei sveikų kontrolinės grupės asmenų33,34,35. Kitame tyrime, kuriame buvo naudojamas PET/KT žymeklis 11C-metil-L-triptofanas, nustatyta, kad triptofano signalo sulaikymo laikas plaučių vėžio audinyje buvo reikšmingai ilgesnis, palyginti su gerybiniais pažeidimais ar normaliu audiniu36. Mes keliame hipotezę, kad triptofano sumažėjimas LA serume gali atspindėti aktyvų triptofano įsisavinimą plaučių vėžio ląstelėse.
Taip pat žinoma, kad galutinis triptofano katabolizmo kinurenino kelio produktas yra NAD+37,38, kuris yra svarbus gliceraldehid-3-fosfato reakcijos su 1,3-bisfosfogliceratu substratas glikolizės metu39. Nors ankstesni tyrimai daugiausia dėmesio skyrė triptofano katabolizmo vaidmeniui imuninės sistemos reguliacijoje, mes siekėme išsiaiškinti triptofano disreguliacijos ir glikolizės kelių sąveiką, pastebėtą šiame tyrime. Yra žinoma, kad tirpiklių transporterių šeimos 7 narys 5 (SLC7A5) yra triptofano transporteris43,44,45. Chinolino rūgšties fosforiboziltransferazė (QPRT) yra fermentas, esantis pasroviui nuo kinurenino kelio, kuris chinolino rūgštį paverčia NAMN46. LUAD TCGA duomenų rinkinio analizė parodė, kad tiek SLC7A5, tiek QPRT raiška naviko audinyje buvo reikšmingai padidėjusi, palyginti su normaliu audiniu (5e pav.). Šis padidėjimas buvo pastebėtas plaučių adenokarcinomos I ir II stadijose, taip pat III ir IV stadijose (papildomas 11 paveikslas), rodantis ankstyvus triptofano metabolizmo sutrikimus, susijusius su naviko atsiradimu.
Be to, LUAD-TCGA duomenų rinkinys parodė teigiamą koreliaciją tarp SLC7A5 ir GAPDH mRNR raiškos vėžiu sergančių pacientų mėginiuose (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5f pav.). Priešingai, normaliame plaučių audinyje reikšmingos koreliacijos tarp tokių genų parašų nerasta (r = 0,25, p = 0,06, 5f pav.). SLC7A5 expressziós slopinimas (12 papildomas pav.) A549 ląstelėse reikšmingai sumažino ląstelių triptofano ir NAD(H) kiekį (5g, h pav.), dėl to sumažėjo glikolizės aktyvumas, matuojamas ekstraląstelinio rūgštėjimo greičiu (ECAR) (1 pav.). 5i). Taigi, remdamiesi metaboliniais pokyčiais serume ir in vitro aptikimu, mes keliame hipotezę, kad triptofano metabolizmas gali gaminti NAD+ per kinurenino kelią ir atlikti svarbų vaidmenį skatinant glikolizę plaučių vėžyje.
Tyrimai parodė, kad didelis skaičius neapibrėžtų plaučių mazgelių, nustatytų atliekant LDKT, gali lemti papildomų tyrimų, tokių kaip PET-KT, plaučių biopsija ir per didelio gydymo, poreikį dėl klaidingai teigiamos piktybinio naviko diagnozės.31 Kaip parodyta 6 paveiksle, mūsų tyrime nustatyta serumo metabolitų grupė, turinti potencialią diagnostinę vertę, kuri gali pagerinti rizikos stratifikaciją ir vėlesnį KT aptiktų plaučių mazgelių gydymą.
Plaučių mazgeliai vertinami naudojant mažos dozės kompiuterinę tomografiją (LDKT), kurios vaizdiniai požymiai rodo gerybines ar piktybines priežastis. Neaiški mazgelių baigtis gali lemti dažnus tolesnius vizitus, nereikalingas intervencijas ir perteklinį gydymą. Diagnostinės vertės turinčių serumo metabolinių klasifikatorių įtraukimas gali pagerinti plaučių mazgelių rizikos vertinimą ir vėlesnį gydymą. PET pozitronų emisijos tomografija.
JAV NLST tyrimo ir Europos NELSON tyrimo duomenys rodo, kad didelės rizikos grupių patikra naudojant mažos dozės kompiuterinę tomografiją (LDKT) gali sumažinti mirtingumą nuo plaučių vėžio1,3. Tačiau sunkiausi išlieka rizikos vertinimas ir vėlesnis klinikinis daugelio atsitiktinai LDKT aptiktų plaučių mazgelių gydymas. Pagrindinis tikslas – optimizuoti teisingą esamų LDKT pagrįstų protokolų klasifikaciją, įtraukiant patikimus biožymenis.
Lyginant plaučių vėžiu sergančius pacientus su sveikų kontrolinių asmenų duomenimis, buvo nustatyti tam tikri molekuliniai biožymenys, pavyzdžiui, kraujo metabolitai15,17. Šiame tyrime daugiausia dėmesio skyrėme serumo metabolomikos analizės taikymui, siekiant atskirti gerybinius ir piktybinius plaučių mazgelius, atsitiktinai aptiktus LDCT. Naudodami UPLC-HRMS analizę, palyginome bendrą sveikų kontrolinių asmenų (HC), gerybinių plaučių mazgelių (BN) ir I stadijos plaučių adenokarcinomos (LA) mėginių serumo metabolomą. Nustatėme, kad HC ir BN metaboliniai profiliai buvo panašūs, o LA, palyginti su HC ir BN, parodė reikšmingus pokyčius. Nustatėme du serumo metabolitų rinkinius, kurie skiria LA nuo HC ir BN.
Dabartinė gerybinių ir piktybinių mazgelių identifikavimo schema, pagrįsta LDCT, daugiausia grindžiama mazgelių dydžiu, tankiu, morfologija ir augimo greičiu laikui bėgant30. Ankstesni tyrimai parodė, kad mazgelių dydis yra glaudžiai susijęs su plaučių vėžio tikimybe. Net ir didelės rizikos pacientams piktybinių navikų rizika mazguose <6 mm yra <1 %. Piktybinių navikų rizika mazgams, kurių dydis yra 6–20 mm, svyruoja nuo 8 % iki 64 %30. Todėl Fleischner draugija rekomenduoja įprastiniam KT stebėjimui taikyti 6 mm skersmens ribą.29 Tačiau neapibrėžtų plaučių mazgelių (IPN), didesnių nei 6 mm, rizikos vertinimas ir gydymas nebuvo tinkamai atliktas31. Dabartinis įgimtų širdies ydų gydymas paprastai grindžiamas budriu laukimu ir dažnu KT stebėjimu.
Remiantis patvirtintu metabolomu, pirmą kartą pademonstravome metabolominių parašų sutapimą tarp sveikų asmenų ir gerybinių mazgelių, kurių dydis mažesnis nei 6 mm. Biologinis panašumas atitinka ankstesnius KT tyrimus, kad mazgelių, kurių dydis mažesnis nei 6 mm, piktybiškumo rizika yra tokia pat maža, kaip ir tiriamųjų be mazgų.30 Reikėtų pažymėti, kad mūsų rezultatai taip pat rodo, jog gerybinių mazgelių, kurių dydis mažesnis nei 6 mm, ir ≥6 mm, metabolominiai profiliai yra labai panašūs, o tai rodo, kad gerybinės etiologijos funkcinis apibrėžimas yra nuoseklus, nepriklausomai nuo mazgelio dydžio. Taigi, šiuolaikinės diagnostinės serumo metabolitų grupės gali suteikti vieną tyrimą kaip išskyrimo testą, kai mazgeliai iš pradžių aptinkami KT, ir potencialiai sumažinti serijinį stebėjimą. Tuo pačiu metu ta pati metabolinių biožymenų grupė atskyrė piktybinius mazgelius, kurių dydis ≥6 mm, nuo gerybinių mazgelių ir pateikė tikslias panašaus dydžio ir neaiškių morfologinių požymių IPN prognozes KT vaizduose. Šis serumo metabolizmo klasifikatorius gerai prognozavo mazgelių, kurių dydis ≥6 mm, piktybiškumą, kai AUC buvo 0,927. Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad unikalūs serumo metabolominiai parašai gali konkrečiai atspindėti ankstyvus naviko sukeltus metabolinius pokyčius ir turėti potencialią vertę kaip rizikos prognozuotojai, nepriklausomai nuo mazgelių dydžio.
Pažymėtina, kad plaučių adenokarcinoma (LUAD) ir plokščialąstelinė karcinoma (LUSC) yra pagrindiniai nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (NSCLC) tipai. Atsižvelgiant į tai, kad LUSC yra stipriai susijusi su tabako vartojimu47, o LUAD yra dažniausia atsitiktinių plaučių mazgelių, aptinkamų atliekant KT tyrimą, histologija48, mūsų klasifikatoriaus modelis buvo specialiai sukurtas I stadijos adenokarcinomos mėginiams. Wang ir kolegos taip pat sutelkė dėmesį į LUAD ir, naudodami lipidomiką, nustatė devynis lipidų parašus, kad atskirtų ankstyvos stadijos plaučių vėžį nuo sveikų asmenų17. Mes išbandėme dabartinį klasifikatoriaus modelį su 16 I stadijos LUSC atvejų ir 74 gerybiniais mazgeliais ir pastebėjome mažą LUSC prognozavimo tikslumą (AUC 0,776), o tai rodo, kad LUAD ir LUSC gali turėti savo metabolominius parašus. Iš tiesų, įrodyta, kad LUAD ir LUSC skiriasi etiologija, biologine kilme ir genetinėmis aberacijomis49. Todėl į mokymo modelius, skirtus plaučių vėžio nustatymui populiacijos pagrindu atrankos programose, reikėtų įtraukti kitų tipų histologiją.
Čia, palyginti su sveikų kontrolinių asmenų ir gerybinių mazgelių grupe, nustatėme šešis dažniausiai pakitusius plaučių adenokarcinomos metabolizmo kelius. Ksantinas ir hipoksantinas yra dažni purinų metabolizmo kelio metabolitai. Remiantis mūsų rezultatais, su purinų metabolizmu susijusių tarpinių produktų kiekis plaučių adenokarcinoma sergančių pacientų serume ar audiniuose buvo reikšmingai padidėjęs, palyginti su sveikų kontrolinių asmenų arba pacientų priešinvazinės stadijos duomenimis15,50. Padidėjęs ksantino ir hipoksantino kiekis serume gali atspindėti anabolizmą, kurio reikia greitai proliferuojančioms vėžio ląstelėms. Gliukozės metabolizmo sutrikimas yra gerai žinomas vėžio metabolizmo požymis51. Čia, palyginti su HC ir BN grupe, pastebėjome reikšmingą piruvato ir laktato padidėjimą LA grupėje, o tai atitinka ankstesnius pranešimus apie glikolizės kelio sutrikimus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (NSCLC) pacientų ir sveikų kontrolinių asmenų serumo metabolomų profiliuose. Rezultatai yra nuoseklūs52,53.
Svarbu tai, kad plaučių adenokarcinomų serume pastebėjome atvirkštinę koreliaciją tarp piruvato ir triptofano metabolizmo. LA grupėje serumo triptofano kiekis buvo sumažėjęs, palyginti su HC arba BN grupe. Įdomu tai, kad ankstesniame didelio masto tyrime, kuriame buvo naudojama perspektyvinė kohorta, nustatyta, kad mažas cirkuliuojančio triptofano kiekis buvo susijęs su padidėjusia plaučių vėžio rizika54. Triptofanas yra nepakeičiama aminorūgštis, kurią gauname tik su maistu. Darome išvadą, kad triptofano kiekio sumažėjimas serume sergant plaučių adenokarcinoma gali atspindėti greitą šio metabolito išeikvojimą. Gerai žinoma, kad galutinis triptofano katabolizmo kinurenino būdu produktas yra de novo NAD+ sintezės šaltinis. Kadangi NAD+ daugiausia gaminamas per gelbėjimo kelią, NAD+ svarba triptofano metabolizme sveikatos ir ligos metu dar nėra nustatyta46. Mūsų TCGA duomenų bazės analizė parodė, kad triptofano transporterio tirpiklių transporterio 7A5 (SLC7A5) ekspresija plaučių adenokarcinomoje buvo žymiai padidėjusi, palyginti su normalia kontroline grupe, ir teigiamai koreliavo su glikolizės fermento GAPDH ekspresija. Ankstesni tyrimai daugiausia buvo skirti triptofano katabolizmo vaidmeniui slopinant priešnavikinį imuninį atsaką40,41,42. Šiame darbe parodome, kad triptofano įsisavinimo slopinimas, slopinant SLC7A5 plaučių vėžio ląstelėse, lemia vėlesnį ląstelių NAD kiekio sumažėjimą ir kartu glikolizės aktyvumo susilpnėjimą. Apibendrinant, mūsų tyrimas pateikia biologinį pagrindą serumo metabolizmo pokyčiams, susijusiems su piktybine plaučių adenokarcinomos transformacija.
EGFR mutacijos yra dažniausios varomosios mutacijos pacientams, sergantiems nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu (NSCLC). Mūsų tyrime nustatėme, kad pacientų, kuriems buvo EGFR mutacija (n = 41), bendri metabolominiai profiliai buvo panašūs į pacientų, kuriems buvo laukinio tipo EGFR (n = 31), nors kai kurių pacientų, kuriems buvo EGFR mutantas, serume nustatėme sumažėjusį lygį pacientams, kuriems buvo acilkarnitinas. Nustatyta acilkarnitinų funkcija yra pernešti acilo grupes iš citoplazmos į mitochondrijų matricą, dėl ko riebalų rūgštys oksiduojasi ir gamina energiją55. Remiantis mūsų išvadomis, neseniai atliktame tyrime, analizuojant 102 plaučių adenokarcinomos audinių mėginių bendrą metabolomą50, taip pat nustatyti panašūs metabolomų profiliai tarp EGFR mutantų ir EGFR laukinio tipo navikų. Įdomu tai, kad acilkarnitino kiekis buvo nustatytas ir EGFR mutantų grupėje. Todėl reikėtų toliau tirti, ar acilkarnitino kiekio pokyčiai atspindi EGFR sukeltus metabolinius pokyčius ir pagrindinius molekulinius kelius.
Apibendrinant, mūsų tyrimas sukuria serumo metabolinį klasifikatorių plaučių mazgelių diferencinei diagnostikai ir siūlo darbo eigą, kuri gali optimizuoti rizikos vertinimą ir palengvinti klinikinį valdymą, pagrįstą KT skenavimo patikra.
Šį tyrimą patvirtino Sun Yat-seno universitetinės vėžio ligoninės etikos komitetas, Sun Yat-seno universiteto Pirmoji dukterinė ligoninė ir Džengdžou universitetinės vėžio ligoninės etikos komitetas. Atradimo ir vidinio patvirtinimo grupėse buvo surinkti 174 sveikų asmenų serumai ir 244 gerybinių mazgelių serumai iš asmenų, kuriems kasmet atliekami medicininiai patikrinimai Sun Yat-seno universiteto vėžio centro Vėžio kontrolės ir prevencijos skyriuje, ir 166 gerybinių mazgelių serumai. I stadijos plaučių adenokarcinomos buvo surinktos iš Sun Yat-seno universiteto vėžio centro. Išorinio patvirtinimo kohortoje buvo 48 gerybinių mazgelių atvejai, 39 I stadijos plaučių adenokarcinomos atvejai iš Sun Yat-seno universiteto Pirmosios dukterinės ligoninės ir 24 I stadijos plaučių adenokarcinomos atvejai iš Džengdžou vėžio ligoninės. Sun Yat-seno universiteto vėžio centras taip pat surinko 16 I stadijos plokščialąstelinio plaučių vėžio atvejų, kad patikrintų nustatyto metabolinio klasifikatoriaus diagnostinį gebėjimą (pacientų charakteristikos pateiktos 5 papildomoje lentelėje). Atradimo kohortos ir vidinio patvirtinimo kohortos mėginiai buvo surinkti nuo 2018 m. sausio iki 2020 m. gegužės mėn. Išorinio patvirtinimo kohortos mėginiai buvo surinkti nuo 2021 m. rugpjūčio iki 2022 m. spalio mėn. Siekiant sumažinti lyčių šališkumą, kiekvienai kohortai buvo priskirtas maždaug vienodas vyrų ir moterų atvejų skaičius. Atradimo komanda ir vidinė peržiūros komanda. Dalyvių lytis buvo nustatyta remiantis savarankišku pranešimu. Iš visų dalyvių buvo gautas informuotas sutikimas ir nebuvo mokamas joks atlygis. Tiriamieji su gerybiniais mazgeliais buvo tie, kurių KT tyrimo balas analizės metu buvo stabilus po 2–5 metų, išskyrus 1 atvejį iš išorinio patvirtinimo mėginio, kuris buvo surinktas prieš operaciją ir diagnozuotas histopatologiniu tyrimu. Išskyrus lėtinį bronchitą. Plaučių adenokarcinomos atvejai buvo surinkti prieš plaučių rezekciją ir patvirtinti patologine diagnoze. Kraujo mėginiai nevalgius buvo surinkti į serumo atskyrimo mėgintuvėlius be jokių antikoaguliantų. Kraujo mėginiai buvo krešinami 1 valandą kambario temperatūroje, o po to centrifuguojami 2851 × g greičiu 10 minučių 4 °C temperatūroje, kad būtų surinktas serumo supernatantas. Serumo alikvotinės dalys buvo užšaldytos -80 °C temperatūroje iki metabolitų ekstrakcijos. Sun Yat-seno universiteto vėžio centro Vėžio prevencijos ir medicininės apžiūros skyrius surinko 100 sveikų donorų, įskaitant vienodą skaičių vyrų ir moterų nuo 40 iki 55 metų amžiaus, serumo mišinį. Vienodi kiekvieno donoro mėginio tūriai buvo sumaišyti, gautas mišinys buvo padalintas į alikvotines dalis ir laikomas -80 °C temperatūroje. Serumo mišinys buvo naudojamas kaip etaloninė medžiaga kokybės kontrolei ir duomenų standartizavimui.
Etaloninis serumas ir tiriamieji mėginiai buvo atšildyti, o metabolitai ekstrahuoti naudojant kombinuotą ekstrakcijos metodą (MTBE/metanolis/vanduo)56. Trumpai tariant, 50 μl serumo buvo sumaišyta su 225 μl ledinio metanolio ir 750 μl ledinio metilo tret-butilo eterio (MTBE). Mišinį išmaišykite ir inkubuokite ant ledo 1 valandą. Tada mėginiai buvo sumaišyti ir sumaišyti sūkuriniu maišytuvu su 188 μl MS klasės vandens, kuriame buvo vidinių standartų (13C-laktatas, 13C3-piruvatas, 13C-metioninas ir 13C6-izoleucinas, įsigyti iš „Cambridge Isotope Laboratories“). Mišinys buvo centrifuguojamas 15 000 × g greičiu 10 min. 4 °C temperatūroje, o apatinė fazė perkelta į du mėgintuvėlius (po 125 μl) LC-MS analizei teigiamu ir neigiamu režimais. Galiausiai mėginys buvo išgarintas iki sausumo greitaeigiame vakuuminiame koncentratoriuje.
Džiovinti metabolitai buvo ištirpinti 120 μl 80 % acetonitrilo, 5 min. maišyti sūkuriniame maišytuve ir 10 min. centrifuguoti 15 000 × g greičiu 4 °C temperatūroje. Supernatantai buvo perkelti į gintaro spalvos stiklinius buteliukus su mikroįdėklais metabolomikos tyrimams. Netaisyklinė metabolomikos analizė atlikta naudojant itin efektyvios skysčių chromatografijos ir didelės skiriamosios gebos masių spektrometrijos (UPLC-HRMS) platformą. Metabolitai buvo atskirti naudojant „Dionex Ultimate 3000 UPLC“ sistemą ir ACQUITY BEH amido kolonėlę (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, „Waters“). Teigiamų jonų režimu mobiliosios fazės buvo 95 % (A) ir 50 % acetonitrilo (B), kiekvienoje iš jų buvo 10 mmol/l amonio acetato ir 0,1 % skruzdžių rūgšties. Neigiamu režimu mobiliosios fazės A ir B turėjo atitinkamai 95 % ir 50 % acetonitrilo, abiejose fazėse buvo 10 mmol/l amonio acetato, pH = 9. Gradiento programa buvo tokia: 0–0,5 min., 2 % B; 0,5–12 min., 2–50 % B; 12–14 min., 50–98 % B; 14–16 min., 98 % B; 16–16,1 min., 98–2 % B; 16,1–20 min., 2 % B. Automatiniame mėginių ėmime kolonėlė buvo palaikoma 40 °C temperatūroje, o mėginys – 10 °C temperatūroje. Srauto greitis buvo 0,3 ml/min., įpurškimo tūris – 3 μl. „Q-Exactive Orbitrap“ masių spektrometras („Thermo Fisher Scientific“) su elektropurškimo jonizacijos (ESI) šaltiniu buvo naudojamas pilno skenavimo režimu ir sujungtas su ddMS2 stebėjimo režimu, kad būtų surinkti dideli duomenų kiekiai. MS parametrai buvo nustatyti taip: purškimo įtampa +3,8 kV/- 3,2 kV, kapiliarų temperatūra 320 °C, apsauginės dujos 40 arb, pagalbinės dujos 10 arb, zondo šildytuvo temperatūra 350 °C, skenavimo diapazonas 70–1050 m/h, skiriamoji geba 70 000. Duomenys buvo gauti naudojant „Xcalibur 4.1“ („Thermo Fisher Scientific“).
Siekiant įvertinti duomenų kokybę, buvo gauti sujungti kokybės kontrolės (KK) mėginiai, iš kiekvieno mėginio paimant 10 μL supernatanto alikvotines dalis. Analitinės sekos pradžioje buvo analizuojamos šešios kokybės kontrolės mėginių injekcijos, siekiant įvertinti UPLC-MS sistemos stabilumą. Tada į partiją periodiškai įpilami kokybės kontrolės mėginiai. Visos 11 šio tyrimo serumo mėginių partijų buvo analizuojamos LC-MS metodu. 100 sveikų donorų serumo mišinio alikvotinės dalys buvo naudojamos kaip etaloninė medžiaga atitinkamose partijose, siekiant stebėti ekstrakcijos procesą ir koreguoti pagal partijų skirtumus. Sun Yat-sen universiteto Metabolomikos centre buvo atlikta netikslinė atradimo kohortos, vidinės patvirtinimo kohortos ir išorinės patvirtinimo kohortos metabolomikos analizė. Guangdongo technologijos universiteto Analizės ir bandymų centro išorinė laboratorija taip pat išanalizavo 40 išorinės kohortos mėginių, kad patikrintų klasifikatoriaus modelio veikimą.
Po ekstrakcijos ir rekonstitucijos absoliutus serumo metabolitų kiekis buvo nustatytas naudojant itin efektyviosios skysčių chromatografijos ir tandeminės masių spektrometrijos metodą („Agilent 6495“ trigubas kvadrupolis) su elektropurškimo jonizacijos (ESI) šaltiniu daugialypės reakcijos stebėjimo (MRM) režimu. Metabolitams atskirti buvo naudojama ACQUITY BEH amido kolonėlė (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, „Waters“). Judančioji fazė sudaryta iš 90 % (A) ir 5 % acetonitrilo (B) su 10 mmol/l amonio acetato ir 0,1 % amoniako tirpalu. Gradiento programa buvo tokia: 0–1,5 min., 0 % B; 1,5–6,5 min., 0–15 % B; 6,5–8 min., 15 % B; 8–8,5 min., 15 %–0 % B; 8,5–11,5 min., 0 % B. Automatiniame mėginių ėmime kolonėlė buvo palaikoma 40 °C temperatūroje, o mėginys – 10 °C temperatūroje. Srauto greitis buvo 0,3 ml/min., o įpurškimo tūris – 1 μl. MS parametrai buvo nustatyti taip: kapiliarinė įtampa ±3,5 kV, purkštuvo slėgis 35 psi, apvalkalo dujų srautas 12 l/min., apvalkalo dujų temperatūra 350 °C, džiovinimo dujų temperatūra 250 °C ir džiovinimo dujų srautas 14 l/min. Triptofano, piruvato, laktato, hipoksantino ir ksantino MRM konversijos buvo atitinkamai 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 ir 151,0–107,9. Duomenys buvo surinkti naudojant „Mass Hunter B.07.00“ („Agilent Technologies“). Serumo mėginiuose triptofano, piruvato, laktato, hipoksantino ir ksantino kiekis buvo kiekybiškai įvertintas naudojant standartinių mišinių tirpalų kalibravimo kreives. Ląstelių mėginiuose triptofano kiekis buvo normalizuotas pagal vidinį standartą ir ląstelių baltymų masę.
Piko ekstrakcija (m/z ir sulaikymo laikas (RT)) buvo atlikta naudojant „Compound Discovery 3.1“ ir „TraceFinder 4.0“ („Thermo Fisher Scientific“). Siekiant pašalinti galimus skirtumus tarp partijų, kiekviena tiriamojo mėginio būdinga smailė buvo padalyta iš tos pačios partijos etaloninės medžiagos būdingos smailės, kad būtų gautas santykinis gausumas. Vidinių standartų santykiniai standartiniai nuokrypiai prieš ir po standartizacijos pateikti 6 papildomoje lentelėje. Skirtumai tarp dviejų grupių buvo apibūdinti klaidingo atradimo dažniu (FDR < 0,05, Wilcoxon ženklų rango testas) ir kartų pokyčiu (> 1,2 arba < 0,83). Neapdoroti ekstrahuotų požymių MS duomenys ir etaloninio serumo pakoreguoti MS duomenys pateikti atitinkamai 1 ir 2 papildomuose duomenyse. Piko anotacija buvo atlikta remiantis keturiais apibrėžtais identifikavimo lygiais, įskaitant identifikuotus metabolitus, tariamai anotuotus junginius, tariamai apibūdintas junginių klases ir nežinomus junginius 22. Remiantis duomenų bazės paieškomis „Compound Discovery 3.1“ („mzCloud“, HMDB, „Chemspider“), biologiniai junginiai, kurių MS/MS atitiko patvirtintus standartus arba tikslias atitikties anotacijas „mzCloud“ (balas > 85) arba „Chemspider“ programose, galiausiai buvo pasirinkti kaip tarpiniai junginiai tarp diferencinio metabolomo. Kiekvieno požymio didžiausios anotacijos pateiktos 3 papildomuose duomenyse. „MetaboAnalyst 5.0“ buvo naudojama vienkryptei sumiškai normalizuoto metabolitų gausumo analizei. „MetaboAnalyst 5.0“ taip pat įvertino KEGG kelio praturtėjimo analizę, pagrįstą reikšmingai skirtingais metabolitais. Pagrindinių komponentų analizė (PCA) ir dalinė mažiausių kvadratų diskriminantinė analizė (PLS-DA) buvo analizuojamos naudojant „ropls“ programinės įrangos paketą (1.26.4 versija) su steko normalizavimu ir automatiniu mastelio keitimu. Optimalus metabolitų biomarkerio modelis mazgelių piktybiškumui prognozuoti buvo sugeneruotas naudojant dvejetainę logistinę regresiją su mažiausiu absoliučiu susitraukimu ir atrankos operatoriumi (LASSO, R paketas v.4.1-3). Diskriminacinio modelio veikimas aptikimo ir patvirtinimo rinkiniuose buvo apibūdintas įvertinant AUC, remiantis ROC analize pagal pROC paketą (v.1.18.0.). Optimali tikimybės ribinė vertė buvo gauta remiantis maksimaliu modelio Youdeno indeksu (jautrumas + specifiškumas – 1). Mėginiai, kurių vertės yra mažesnės arba didesnės už ribą, bus prognozuojami atitinkamai kaip gerybiniai mazgeliai ir plaučių adenokarcinoma.
A549 ląstelės (#CCL-185, Amerikos tipų kultūrų kolekcija) buvo auginamos F-12K terpėje, kurioje buvo 10 % FBS. Trumpų plaukų segtukų RNR (shRNR) sekos, nukreiptos prieš SLC7A5 ir netikslinę kontrolę (NC), buvo įterptos į lentivirusinį vektorių pLKO.1-puro. shSLC7A5 antisensinės sekos yra tokios: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antikūnai prieš SLC7A5 (#5347) ir tubuliną (#2148) buvo įsigyti iš „Cell Signaling Technology“. Antikūnai prieš SLC7A5 ir tubuliną buvo naudojami 1:1000 praskiedimu Western blot analizei.
„Seahorse XF“ glikolizės streso testas matuoja ekstraląstelinio rūgštėjimo (ECAR) lygį. Tyrimo metu gliukozė, oligomicinas A ir 2-DG buvo skiriami nuosekliai, siekiant ištirti ląstelių glikolizės pajėgumą, išmatuotą ECAR metodu.
A549 ląstelės, transfekuotos netiksline kontrole (NC) ir shSLC7A5 (Sh1, Sh2), buvo per naktį dedamos į 10 cm skersmens lėkšteles. Ląstelių metabolitai buvo ekstrahuoti 1 ml ledinio 80 % vandeninio metanolio tirpalo. Metanolio tirpale esančios ląstelės buvo nugramdytos, surinktos į naują mėgintuvėlį ir centrifuguotos 15 000 × g greičiu 15 min. 4 °C temperatūroje. Surinkite 800 µl supernatanto ir išdžiovinkite naudodami didelės spartos vakuuminį koncentratorių. Džiovintų metabolitų granulės buvo analizuojamos triptofano kiekiui nustatyti naudojant LC-MS/MS, kaip aprašyta aukščiau. Ląstelių NAD(H) kiekis A549 ląstelėse (NC ir shSLC7A5) buvo matuojamas naudojant kiekybinį NAD+/NADH kolorimetrinį rinkinį (#K337, BioVision) pagal gamintojo instrukcijas. Kiekvienam mėginiui buvo matuojamas baltymų kiekis, siekiant normalizuoti metabolitų kiekį.
Preliminariai imties dydžiui nustatyti nebuvo naudojami jokie statistiniai metodai. Ankstesni metabolomikos tyrimai, skirti biožymenų atradimui15,18, buvo laikomi dydžio nustatymo etalonais, ir, palyginti su šiomis ataskaitomis, mūsų imtis buvo tinkama. Iš tyrimo kohortos nebuvo pašalinta nė viena imtis. Serumo mėginiai buvo atsitiktinai priskirti atradimo grupei (306 atvejai, 74,6 %) ir vidinės patvirtinimo grupei (104 atvejai, 25,4 %) netiksliniams metabolomikos tyrimams. Taip pat atsitiktinai atrinkome 70 atvejų iš kiekvienos grupės iš atradimo rinkinio tiksliniams metabolomikos tyrimams. Tyrėjai nebuvo informuoti apie grupių priskyrimą renkant ir analizuojant LC-MS duomenis. Metabolomikos duomenų ir ląstelių eksperimentų statistinė analizė aprašyta atitinkamuose skyriuose „Rezultatai“, „Paveikslų aprašai“ ir „Metodai“. Ląstelių triptofano, NADT ir glikolizės aktyvumo kiekybinis įvertinimas buvo atliktas tris kartus nepriklausomai, gaunant identiškus rezultatus.
Daugiau informacijos apie tyrimo dizainą rasite su šiuo straipsniu susijusioje „Natural Portfolio“ ataskaitos santraukoje.
Neapdoroti išskirtų požymių MS duomenys ir normalizuoti etaloninio serumo MS duomenys pateikti atitinkamai 1 papildomuose duomenyse ir 2 papildomuose duomenyse. Diferencinių požymių smailių anotacijos pateiktos 3 papildomuose duomenyse. LUAD TCGA duomenų rinkinį galima atsisiųsti iš https://portal.gdc.cancer.gov/. Grafiko braižymo įvesties duomenys pateikti šaltinio duomenyse. Šio straipsnio šaltinio duomenys pateikiami.
Nacionalinė plaučių atrankinės patikros tyrimų grupė ir kt. Mirtingumo nuo plaučių vėžio mažinimas mažos dozės kompiuterine tomografija. Šiaurės Anglija. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ir Prophet, PC. Plaučių vėžio patikra naudojant mažos dozės spiralinę KT: Nacionalinio plaučių patikros tyrimo (NLST) rezultatai. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ ir kt. Plaučių vėžio mirtingumo mažinimas taikant tūrinę KT patikrą atsitiktinių imčių tyrime. Šiaurės Anglija. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Įrašo laikas: 2023 m. rugsėjo 18 d.